生物化学14重点.ppt

* * 第十四章 核酸的物理化学性质 一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收 四、核酸的变性、复性及杂交 一、核酸的水解 （一）酸水解 对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键 嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键 脱嘌呤： pH1.6，37℃，对水透析 pH2.8，100℃，1h 脱嘧啶： 98-100%甲酸，175℃，2h 三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或 80min（RNA） 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成 （二）碱水解 RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.3～1mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。 DNA抗碱水解 生理意义： DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。 （三）酶水解 非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5′-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3′-核苷酸 特异的磷酸二酯酶： 核酸酶 1、核酸酶的分类 ★底物专一性： 核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase ★作用方式： 核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶 (endonuclease) 单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶 ★磷酸二酯键的断裂方式： 5′-（寡）核苷酸 3′-（寡）核苷酸 2、RNAase ★RNase H 作用于DNA-RNA中的RNA链 ★牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , RNase I 最适pH ：7.0-8.2 产物：3′-嘧啶核苷酸或以其为结尾的寡核苷酸。高度专一的内切酶 ★RNase T1 耐热、耐酸 产物：3′-鸟苷酸或以其为结尾的寡核苷酸，专一性更高 ★RNase T2 产物：将tRNA完全水解为以3′-腺苷酸结尾的寡核苷酸 3、DNase ★核酸酶S1 作用于单链DNA部分 ★牛胰脱氧核糖核酸酶，DNase I 切断双链或单链DNA，产物：以5′-磷酸为末端的寡核苷酸 ★牛脾脱氧核糖核酸酶，DNase Ⅱ 产物：以3′-磷酸为末端的寡核苷酸 ★DNA限制性内切酶 4、N-糖苷酶 二、? 核酸的酸碱性质 磷酸和碱基均能发生两性解离。 DNA等电点 4～4.5 RNA等电点 2～2.5 1、碱基的解离 P504 2、核苷的解离 P505 3、核苷酸的解离 核苷酸的解离曲线 pK1? = 0.9 第一磷酸基 pK3? = 6.2 第二磷酸基 pK2? = 3.7 含氮环 腺嘌呤核苷酸 pK1? = 0.7 第一磷酸基 pK3? = 6.1 第二磷酸基 pK2? = 3.7 含氮环 烯醇式羟基 鸟嘌呤核苷酸 pK1? = 0.8 第一磷酸基 pK3? = 6.3 第二磷酸基 pK2? = 4.3 含氮环 胞嘧啶核苷酸 pK1? = 1.0 第一磷酸基 pK3? = 6.4 第二磷酸基 烯醇式羟基 尿嘧啶核苷酸 pH 离子化程度 小牛胸腺DNA的滴定曲线 pH 三、核酸的紫外吸收 碱基、核苷、核苷酸和核酸在240～290nm的紫外波段有强烈的光吸收，　λmax=260nm 1、鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 2、含量计算 1ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应） 四、核酸的变性、复性及杂交 (一)变性 核酸变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。 ★变性因素： 热变性 酸碱变性（pH小于4或大于11） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛） ★变性后的理化性质： 260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。 220 240 260 280 0.1 0.2 0.3 0.4 波长（nm） 光吸收 1 2 3 天然DNA 变性DNA 核苷酸总吸收值 1 2 3 ★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为解链温度（Tm）。 浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链），A260= 1.37。当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。