生物化学第2章Ⅱ核酸重点.ppt

第四节 核酸的性质 一、一般物理性质 二、核酸的水解 三、核酸的两性性质 四、核酸的紫外吸收性质 五、变性、复性与杂交 1 酸水解 碱水解 酶水解 1 酸水解 糖苷键和磷酸键都能被酸水解,糖苷键比磷酸键更容易 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶的对酸更不稳定,最不稳定是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键 2 碱水解 DNA和RNA对碱的耐受程度有很大差别。室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解。 例如，室温条件下，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解；DNA在同样条件下则不受影响。但温度100度时，4个小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。 在核酸在260 nm附近有最大吸收峰；据此特性可以定性和定量检测核酸。蛋白质在280 nm有一定的吸收峰，因此利用D260/OD280比值可判断核酸样品的纯度。 （一）、DNA的变性 1、概念 2、变性因素 3、变性的指标 1、概念 是指核酸双螺旋区的氢键断裂，双螺旋解开，变成无规则线团的现象。核酸变性其分子中的共价键并没有破坏，分子量也不改变，核酸的变性（ denaturation ） 2、DNA的变性的因素 温度升高； 酸碱度改变、 pH（11.3或5.0）； 有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等； 各种射线 低离子浓度 DNA的复性图示 （三）、分子杂交 热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。 Southern Blot：DNA-DNA杂交 Northern Blot：DNA-RNA杂交 PCR技术 分子杂交的种类 Southern Blot：DNA-DNA杂交 Northern Blot：DNA-RNA杂交 Western Blot：抗原-抗体进行杂交 原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光 第五节 核酸的研究方法 一 核酸的分离、提纯和定量测定 二 核酸的凝胶电泳 三 序列测定 四 化学合成 五 PCR 三 序列测定 1 DNA酶法测序 2 DNA的化学法测序 3 RNA的测序 DNA酶法测序 Sanger 于1975年设计快速测序方法”加减法” 2、影响DNA的复性的因素 分子量越大复性越难。 浓度越大，复性越容易。 DNA的复性需要一定的盐浓度，增加盐浓度，复性速度加快 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。即淬火。 但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（annealing) 退火温度＝Tm－25℃ 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。 第一节 概述 第二节 核酸的化学组成 第三节 核酸的分子结构 第四节 核酸的性质 第五节 核酸的研究方法 第五节 核酸的研究方法 一 核酸的分离、提纯和定量测定 二 核酸的凝胶电泳 三 序列测定 四 PCR 五 化学合成 第五节 核酸的研究方法 一 核酸的分离、提纯和定量测定 (一) 核酸的分离、提纯 (二) 定量测定 第五节 核酸的研究方法 一 核酸的分离、提纯和定量测定 (一)核酸的分离、提纯 1、DNA 2、RNA 目前分离DNA方法： 盐抽提，用苯酚和氯仿去蛋白 SDS/CTAB 氯化铯密度梯度离心 SDS法小量制备 植物基因组DNA的原理 在含有去污剂，如SDS或CTAB的溶液中，植物细胞会被裂解释放出细胞核中的基因组DNA，通过氯仿/异戊醇的抽提和离心去除掉裂解液中的细胞碎片、蛋白质以及其它杂质，这时的基因组DNA分配在水相中。 然后用乙醇(或异丙醇)将水相的DNA分子沉淀出来，最后溶于TE缓冲液或纯水中备用。 剪取新鲜的植物叶片约20mg，剪碎置于1.5ml离心管中； 向离心管中缓慢加入液氮冷冻植物叶片； 在液氮蒸发去2/3时，用自制研杵迅速磨碎叶片； 立即加入300uL 65℃预热的提取液摇匀，于65℃水浴约1hr，其间摇动数次； 加等体积氯仿/异戊醇（24:1）混匀，于12000 rpm离心5分； 转移上清液到另一干净1.5ml离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后静置2min，14000rpm离心5min； 倾去上清液并用200uL预冷乙醇（70%）清洗DNA沉淀，14000rpm离心5min； 用枪头小心吸去乙醇，自然风干DNA后溶于50uL ddH2O中，置-20℃保存备用。 植物基因组DNA的小量快速制备方案 2、RNA 注意：用高温（180度）或