生物化学第4章重点.ppt

肽基的C、O和N原子间的共振相互作用 消化道内几种蛋白酶的专一性 不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基 不同生物与人的Cytc的AA差异数目 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 末端基氨基酸测定 肼解法 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 末端基氨基酸测定 羧肽酶(carboxypeptidase)法 （三）二硫桥的断裂 断裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。 s s HCOOOH SO3H SO3H S S S S S S 胰岛素 HO-CH2-CH2-SH SH SH SH SH SH SH SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H ICH2COOH 作用：这些反应可用于巯基的保护。 巯基（-SH）的保护 （四）氨基酸组成的分析 用于蛋白的氨基酸组成测定的水解方法主要是酸水解，同时辅以碱水解。 氨基酸分析仪图谱 （五）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化 1.酶裂解法 胰蛋白酶(trypsin) 这是最常用的蛋白水解酶，专一性强，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。得到的是以Arg或Lys为C-末端残基的肽段，肽段数目等于多肽链中Arg和Lys总数加1。 为了减少胰蛋白酶的作用位点，可以通过化学修饰将其侧链基因保护起来。用马来酸酐可以保护Lys残基侧链上的ε－NH2，胰蛋白酶就不会水解Lys竣基参与形成的肽键，只能断裂Arg羧基所形成的肽键；反之，如果用1，2－环己二酮修饰Arg的胍基，则胰蛋白面只能裂解Lys羧基所形成的肽键。 如果想增加多肽链中胰蛋白酶的断裂点，可以用丫丙啶处理多肽链样品，这时Cys残基侧链被修饰成类似Lys的侧链，也具有ε－NH2。这样胰蛋白酶便能断裂Cys羧基端的肽键。 R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。 糜蛋白酶(chymotrypin)或胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)：它断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键。断裂键邻近的基团是碱性的，裂解能力增加；是酸性的，裂解能力将减弱。 肽链 水解位点 R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。 R2=Pro 水解受抑。 肽链 水解位点 胃蛋白酶(pepsin) 它要求被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸，如Phe-Phe。此外与糜蛋白酶不同的是酶作用的最适pH，前者是pH2，后者是pH8-9，由于二硫键在酸性条件下稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。 R1和R2＝Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。 R1=Pro 水解受抑。 肽链 水解位点 嗜热菌蛋白酶（thermolysin）:常用于断裂较短的多肽链。 R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。 R2=Pro或Gly 水解受抑。 R1或R3=Pro 水解受抑。 葡萄球菌蛋白酶（Staphylococcal protease) 当裂解在磷酸缓冲液(pH7.8)中进行的，它能在Glu残基和Asp残基的羧基侧断裂肽键。如果改用碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)或醋酸铵缓冲液(pH4.0)时，则只能断裂Glu残基的羧基侧肽键。 梭菌蛋白酶（clostripain） 专门裂解Arg残基的羧基所形成的肽键。即使在6mol/L尿素中20小时内仍具活力，这样对不溶性蛋白质的长时间裂解将是很有效的。 （Phe.Tyr.Trp） （Arg.Lys） （脂肪族） 胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶 弹性蛋白酶 羧肽酶 胰蛋白酶 氨肽酶 羧肽酶 （Phe. Trp） 2. 化学裂解法 溴化氰只断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键。 羟胺能专一性地断裂—Asn-Gly—之间的肽键。但专一性不很强，如—Asn-Leu—及—Asn-Ala—键也能部分裂解。 肽段的分离提纯 多肽链用上述方法断裂后，所得的肽段混合物通常使用凝胶过滤、凝胶电泳、离子交换纤维素和离子交换萄聚糖柱层析、高效液相色谱、高效薄层层析等方法进行分离提纯。 1.Edman化学降解 （