生物化学-分子杂交重点.ppt

分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology 原位杂交技术可分析基因在染色体上的位置 原位杂交（in situ hybridization,ISH）是利用分子杂交技术对基因在染色体上定位的一种技术。 基本程序是细胞或组织固定→预杂交→杂交→冲洗→放射自显影或标记酶显色→分析结果。 原位杂交的特点是杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行。 荧光原位杂交（FISH）是一种非放射性原位杂交方法，用特殊荧光素标记核酸（DNA）探针； 已有多重原位杂交，分辨率可达100～200kb. * 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理 （一）印迹技术 应用：核酸靶DNA或RNA序列的定性与定量分析。 （二）探针技术 探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 探针的种类： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 人工合成的寡核苷酸探针 5’?3’外切酶活性 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 Paper Towels Southern Blot tissue SDS ProtK Phenol Chloroform ethanol precipitation Spin Agarose Gel Electrophoresis _ + 3 Southern analysis 限制性内切酶谱分析法 限制性内切酶 特异性DNA探针 待测序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶酶切位点发生改变，导致酶谱的改变（如特异性片段的大小和多少改变），使得电泳迁移率改变 × MstⅡ酶切位点(GCTNAGG) 5′ 3′ 正常基因 5′ 3′ 突变基因 1.15kb 1.35kb 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 + ﹣ 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人 突变携带着 患者 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 RLFP分析法 中性突变：人基因组中，平均每200对碱基可发生一次突变，这种突变对生物体的生存既没有好处，也没有害处。 DNA多态性：中性突变导致个体间核苷酸序列的差异。 限制性片段长度多态性:由于多态性发生限制性酶切位点上，导致导致酶切可产生长度不同的片段。 RNA印渍技术主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。 Northern Blot 放射自显影照片 目 录 RNA琼脂糖凝胶电泳 3kb 0.4 kb Nt 3638 2604 623 Northern blot hybridization 应用举例 GAPDH 0d 2d 4d 6d 8d Northern blot 杂交分析mRNA的表达 靶 mRNA Western Blot 三种印迹技术的比较 其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip) 菌落原位杂交 *