啤酒酵母蔗糖酶的提取、纯化及测定研究重点.doc

浙江工业大学海洋学院 生物化学实验论文 专业：食 品 科 学 与 工程 班级：食 品1201 姓名：徐 素 媛 啤酒酵母蔗糖酶的提纯及相关性质测定研究 作者：徐素媛 单位：浙江工业大学海洋学院食工1201班 摘要：为了了解酶的提取及及初提纯方法，并在此基础上掌握Q Sepharose-柱层析法提纯酶、DNS法测定酶活力、Folin-酚法和微量凯式定氮法测定蛋白含量以及SDS测定蛋白质分子量的原理和方法，需要进行一系列的实验，主要实验过程如下：啤酒酵母自溶后经多次分别离心得到初提液A、热提取液B和乙醇提取液C。利用Q Sepharose-柱层析法洗脱乙醇提取液C得到洗脱液，通过测定洗脱液的吸光值及酶活力的定性测定，选取活力最高的洗脱液得到柱分离液D。接着进行定量酶活力测定，根据葡萄糖标准曲线的方程计算4个样品的总活力单位数和酶回收率，并得出随着蔗糖酶的不断提纯，酶的总活力单位数和酶回收率都逐渐减小。随后用Folin-酚试剂法测样品中蛋白质的含量，与用微量凯氏定氮法测定的结果进行比较，后者测出的总蛋白含量比前者大，并得出A、B、C、D4个样品的比活力在一步步的纯化中逐渐升高，纯化倍数也明显增大，而总酶活、总蛋白和蛋白回收率却在下降。最后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法通过凝胶对样品的筛选分离、染色、洗脱等步骤测量蛋白质分子和染料的迁移距离来间接测定蔗糖酶的相对分子质量。 关键词：蔗糖酶 提纯 酶活力 Folin-酚法 微量凯式定氮法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 正文： 1、文献综述 1.1 总述 啤酒酵母也叫营养酵母，为酵母科、酿酒酵母属，可作食用、药用和饲料酵母，还可以从其中提取核酸、谷胱甘肽、蔗糖酶、细胞色素c等营养物质[1]从啤酒酵母中提取蔗糖酶的一般工艺过程包括提取和分离纯化以及相关性质测定[2]。 1.2 蔗糖酶的提取 蔗糖酶(Sucrase，EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β-1，2糖苷键，并将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases, EC 3.2.1.26）和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases, EC3.2.1.20）。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取[3]。酵母蔗糖酶的提取可采用酵母自溶法、冻融法和SDS抽提法，用不同提取方法所得蔗糖酶的活性不同，实验研究表明，SDS抽提法的酶活性最高，冻融法次之，常规的甲苯自溶法酶活性 最低。SDS抽提法提取效率最高最高，还具有操作简便易行、生产成本低、回收率高等特点，更适合酵母蔗糖酶的工业化大规模生产[4]。 1.2 蔗糖酶的纯化 1.2.1 初步纯化 蔗糖酶的初步纯化一般采用热提取法、乙醇沉淀提取法，并在此过程中应用离心的方法，得到蔗糖酶的初提取液。 1.2.2 离子交换层析法 离子交换层析是分离蛋白质应用最广泛的技术，蛋白质的两性特征意味着它们可以依pH值不同而呈阳离子或阴离子状态存在。其等电点决定了所用介质的pH值及所选离子交换剂的类型。蔗糖酶的等电点在酸性，在pH=7.3条件下选择阴离子交换剂。蛋白质与离子交换剂之间结合的强度取决于蛋白质上共同发挥作 用的离子基团数目、离子交换剂上电荷的密度以及流动相的离子强度。因此，蛋白质的洗脱可用离子强度递增的梯度方式进行，也可用pH梯度方式进行。由于 pH的变化可能导致酶的失活，故一般用离子强度递增的方法来纯化酶。提高分离效果的实验条件选择可以从以下三方面考虑：（1）离子交换剂类型的选择； （2）洗脱液pH选择；（3）洗脱液的离子强度的选择。通过实验，比较DEAE-纤维素层析法、DEAE Sepharose层析法和Q Sepharose层析法，得出采用DEAE-纤维素层析法的结果是穿透峰大，且穿透峰的酶活很大，说明纤维素吸附蔗糖酶的量很少，即介质载量低,柱容量低，导致回收率低。由于穿透峰大，得到的洗脱峰很小，且酶活也很低，有时测得的酶活峰不在蛋白峰上，达不到实验效果，通过比较最终得出Q Sepharose层析法的效果最好，其具有如下特点：（1）提高实验效果。琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高，分离纯化蔗糖酶穿透峰小，分辨率高，回收率高，蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离，提高纯度，真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性。（2）缩短实验时间。梯度洗脱时间大大减少。（3）节约实验支出。离子交换介质DEAE-纤维素由于流速慢，柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变，不能承受0.1M以上NaOH清洗，重生效果差，寿命短。琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性，且其化学稳定性极高，不