口腔生物学实验总结.ppt

实验方法： 1. 分离破骨细胞 取新出生的白兔5只用肥皂水洗涤三次→清水冲净→断头处死→浸泡于75%乙醇中1分钟→去皮分离股骨、肱骨、胫骨和颅盖骨→置盛有60ml Hanks液的培养皿 →刮除软组织及软骨骺→置Hanks液洗2次→移入12ml含有抗生素的199培养液 纵行剖开骨→以手术刀轻刮骨的内表面→用尖吸管反复吸取培养液冲洗骨髓腔内表面至色发白为止→静置1分钟，取悬液备用。 主要实验设备与器材： 第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养 2. 骨片制备 将放至-70?C冰箱中储存的牛股骨取出，在冲水降温的条件下分切成6mm ×6mm×0.2mm大小的骨片，并用不同粗细的砂纸磨成10μm厚。 将骨片置生理盐水中于超声波清洗器上处理5分钟×3次。 将超声处理后的骨片浸入含抗生素的199培养液中浸泡5分钟～10分钟×3 次。 3. 破骨细胞培养 取24孔板，孔内分别放入骨片和盖玻片，并分别加入1ml199培养液，置5%CO2培养箱中恒温预热1小时。 每孔加入0.5ml上述制备的细胞悬液，培养15小时～20小时后，吸去悬液，用199培养液冲洗未贴壁的细胞，继续培养并观察骨片被吸收的情况，根据细胞生长、骨片吸收情况和实验需要，决定培养终止时间。 4. 破骨细胞鉴定 用倒置相差显微镜或电镜观察；酸性磷酸酶或降钙素染色后鉴定。 第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养 4. 破骨细胞鉴定 （1）倒置相差显微镜观察培养破骨细胞的形态； （2）HE染色：生长有细胞的盖玻片分别于3天～7天取出，80%乙醇固定，HE染色，脱水，二甲苯透明，树胶封片，光镜观察； （3）甲苯胺兰染色：将细胞盖玻片置甲醇中固定10分钟，1%甲苯胺兰染色3分钟，95%乙醇分色、蒸馏水冲净，空气干燥后二甲苯透明、树胶封片，光镜观察； （4）抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色进行破骨细胞鉴定：将细胞爬片置37℃温箱中5分钟干燥后，置2.5%的戊二醛中4℃固定10分钟，然后用孵育液温育至37℃，双蒸水洗3次，苏木素复染2分钟，自来水冲洗反蓝，晾干、二甲苯透明、树胶封固，光镜观察。 第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养 （5）破骨细胞骨吸收活动的观察： 甲苯胺兰染色：培养的第7天取出培养板中的骨片，2.5%戊二醛固定7分钟，于0.25mmol/L氢氧化铵中超声清洗5分钟×3次，系列酒精脱水，自然晾干，含1%硼酸钠的1%甲苯胺蓝染色3分钟，自然晾干后光学显微镜下观察。 用扫描电镜观察破骨细胞在骨磨片上形成的骨吸收陷窝：经破骨细胞培养至10天的骨片以0.25 mol/L氢氧化铵超声处理10 分钟，清除骨片上的破骨细胞，再以2.5%戊二醛固定、1%锇酸固定、酒精系列脱水、 醋酸异戊酯置换酒精后，二氧化碳临界点干燥、喷金后扫描电镜观察。 第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养 倒置相差显微镜可见骨片上破骨细胞吸收陷窝 破骨细胞TRAP染色胞浆呈红色 结果分析与实验报告评定：破骨细胞的分离培养与鉴定 注意事项: 破骨细胞在体外具有形成骨吸收陷窝的功能，但是由于其是终末分化细胞，不能分裂，故其分离、培养一般只能存活10天以内；可以观察破骨细胞与骨片共培养后1天～10天内的不同时间的变化。 由于破骨细胞的生活习性是贴壁生长，所以分离破骨细胞时，要使用胰蛋白酶进行消化，去除周边的成纤维细胞，只留下贴壁的破骨细胞，才能使破骨细胞得以充分伸展和移动，也才能使其功能研究便于观察。 第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养 实验目的与要求： 通过本实验学习要求掌握用MTT法测定细胞增殖活性的基本方法，学会使用酶标仪检测吸光度，应用生物软件或Excel绘制实验结果图，并了解解析结果的意义。 实验原理： 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性蓝紫色结晶甲瓒（formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪测定其在波长490nm处的吸收光值，可间接反映活细胞数量。在一定数量范围内，100U/ml MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。 实验内容： MTT法测定不同浓度药物如尼古丁对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响； 用酶标仪检测吸光度值； 应用生物软件或Excel绘制实验结果图，解析结果的意义。 实验十二 MTT法检测细胞活性 第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养 实验主要设备和器材： 实验方法： 调细胞浓度培养 加药后再培养 加MTT 加DMSO 酶标仪检测OD490nm值 第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养 实验方法： 将培养至对数生长期的口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113稀释成2.5×104个 /ml后，接种于96孔板，每孔200μl，置5%CO2、37?C恒温培养24小时至