2基因研究技术之制备与检测.ppt

思考题： 采用PCR技术扩增目的片段时，如何获得单一的特异性扩增产物？ 检测重组体克隆的菌落杂交技术 6.蛋白质/核酸杂交技术 凝胶阻滞检测 DNaseⅠ足迹检测 硫酸二甲酯（DMS）足迹检测 甲基化干扰检测 凝胶阻滞检测（Gel retardation assay） DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay） 80年代初期，在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷， 分离纯化特定DNA结合蛋白质 原理：DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。 凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带 A C B 放射自显影 * * * * 凝胶电泳 放射性标记的DNA 细胞蛋白质提取物 蛋白质与DNA结合 * * * * * * B DNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢 滞后带表明DNA与蛋白质结合 鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定DNA片段结合的蛋白质分子 研究发生此种结合之精确的DNA序列的特异性。（加入超量的非标记竞争DNA） (a) (b) (c) 在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用 （a）没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（b）加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（c）竞争DNA与探针DNA分别结合不同的蛋白质，出现同（a）一样的阻滞条带。 * * * * * * * * * * 蛋白质与未标记的竞争DNA结合 凝胶电泳 放射自显影 蛋白质与标记的探针DNA结合 * * * * * * * * * * 可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。 1. 用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子 2. 在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。 凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位。 DNaseⅠ足迹实验可以解决这个问题 DNase I －DNase，牛胰脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，只能水解DNA磷酸二酯键的酶 优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链和单链DNA 产物是以5’-磷酸为末端的寡核苷酸和单核苷酸混合物 切割位点随机分布 DNaseⅠ足迹检测（ DNaseⅠ footprinting assay） 一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。 足迹实验的一个明显优点：可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。 32p 1 5 10 * 1 4 8 10 * 加入蛋白质X 加入DNaseI凝胶电泳放射自显影 1 5 10 A B 足迹 (a) (c) (b) DNaseI 足迹实验 hormone-receptor complexes that bind to their hormone response elements transcription factors that bind eukaryotic operators, enhancers, and silencers the lac repressor that shuts down the?lac operon in E. coli 如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。 如同凝胶阻滞实验一样，也可加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。 硫酸二甲酯（DMS）足迹检测： DMS使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化 六氢吡啶特异切割甲基化G残基 结合蛋白DNA片段上的G残基，不被甲基化，从而避开六氢吡啶的切割作用。 DNA片段的序列中，不存在具这些G残基末端的DNA片段，出现了空白区 甲基化干扰检测 methyltion interference assay 利用此原理，设计出的研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法 可检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对后续的蛋白质结合作用会有什么效