5 克隆动物-细胞工程.ppt

克隆技术的应用 干细胞生产 复制人体器官，即治疗性克隆 扩大优良畜群、转基因动物的数量 拯救濒危野生动物 为细胞生物学、遗传学等学科提供实验手段和遗传均质的实验动物 * 理论不成熟，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 成功率很低。1/277 多莉；克隆动物先天缺陷 克隆动物体细胞突变，寿命和其他遗传问题。 社会学和伦理学的问题 克隆技术存在的问题 * 如何看待克隆人？？ 解决生育障碍 珍稀动物保护 治疗疾病 伦理学角度 人权角度 计划生育 ………… ………… ………… * 直至此时,核移植所用的供体细胞均为囊胚阶段以前的胚胎细胞。当时人们普遍认为，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后则随着分化而逐渐丧失其全能性。 * 体细胞核移植技术 -------动物克隆技术的里程碑 * 体细胞核移植技术(somatic cell unclear transplantation)是指，将分化程度较高的体细胞移植入去核的卵母细胞中构建新合子的生物技术。 体细胞核移植 * 历史回顾 1996年，世界第一例从成年动物细胞克隆出的哺乳动物绵羊多莉诞生。这个秘密直到1997年2月才向世人公布。 1997年7月，苏格兰科学家在实验室内将一个人类基因导入绵羊体细胞，克隆了带有人类基因的绵羊“波莉”。 * 1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。 此后，体细胞核移植技术在牛、山羊、猪等多种动物获得成功。 至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。 * 多莉的诞生过程 * * 体细胞核移植程序 核供体细胞的准备 受体卵母细胞的准备 重构胚的激活 重构胚的培养 移植给代孕动物 去核卵母细胞 细胞周期调控后的体细胞 融合后形成重构胚 装核 * 核供体细胞的准备 常用的体细胞有： 卵丘细胞 颗粒细胞 皮肤成纤维细胞 细胞在体外一般在体外传代8-16次 * A 组织块培养的人皮肤成纤维细胞 B 消化培养的人皮肤成纤维细胞 * 受体细胞准备 目前为止，有三类用于核移植产生了后代 第一类是去除原核的受精卵 第二类是早期胚胎； 第三类即是MⅡ期的卵母细胞。 常用的是MⅡ期的卵母细胞，一般通过超数排卵和体外成熟培养获得 * 去核的方法 1.盲吸法 2.半卵法 3.荧光引导核法 4.微分干涉显微镜去核法 5.功能性去核法 6.离心去核法 7.末期去核法 * 用细胞骨架抑制剂---细胞松弛素或秋水仙碱处理卵母细胞，使细胞骨架松弛而质膜不易破碎。 用微细玻璃管插入第一极体，吸取第一极体及处于分裂中期的染色体。 * 去 核 过 程 * 装核 将准备好的体细胞核放入去核卵母细胞的过程。 将体细胞放入带下 * 图2 核移植的显微操作过程 A 显微注射针刺入卵母细胞前 B开始吸取第一极体 C 极体已被吸入注射针 D 去除极体后的卵母细胞 E 注射供体细胞核 F 供体细胞核已被注入 A C D E F B * 直接注射法 * 4.细胞融合 细胞融合的方法有： 病毒介导融合 化学融合 电融合 * 利用电穿孔的原理来使细胞融合。为使供/受体细胞的接触面与电场方向垂直,更有利于融合,可在待融的供/受体复合物移入两微电极丝所组成的融合小槽内后用一次交流脉冲或手工排步的方式来达到这一目的。 * 卵母细胞与体细胞电融合过程 * 重构卵激活 正常情况下,受精过程中，精子进入卵子后,卵母细胞质中会出现一系列的反应,如游离Ca2+ 浓度增高、母源性的mRNA启动转录、MPF等因子活性下降等。这些反应是卵母细胞被激活的标志，不经过这些变化,胚胎就不能正常发育。 核移植过程中的激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用。 目前，激活的方式有电激活、化学激活和注射精子因子激活三种。 化学激活常用药品有：钙离子载体（A23187）、7%乙醇、离子霉素、6-DMAPSrCl2 * 重构胚的培养 重构胚移入受体之前的培养方法有体外培养和体内培养两种方法。体外培养法相对要简单、方便的多。 目前为大部分核移植所采用。 * 人类体细胞核移植技术 * 历史回顾 2001年，美、意科学家联手展开克隆人的工作。 2001年