5、菌株纯化与细菌生理生化实验.ppt

实 验 五 菌株纯化与细菌生理生化实验 目的要求 加深对微生物分布广泛性的认识。 平板菌落计数法。 从细菌培养物中纯化菌株。 掌握菌种保藏的准备工作。 细菌对大分子分解的检测方法。 实验材料 上次实验分离培养的微生物 肉膏蛋白胨固体培养基（现制） 灭菌的培养皿 酒精灯、接种针、试管、棉塞等 菌种：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌。 检测用培养基：淀粉培养基、油脂培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（现制） LB培养基：下次实验使用。 实验内容1：平板菌落计数 含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落。故可根据平板上菌落的数目，推算出每克样品中所含的活菌总数。 一般由三个稀释度计算出的每克含菌样品中的总活菌数和同一稀释度出现的总活菌数均应很接近，不同稀释度平板上出现的菌落数应呈规律性地减少。如相差较大，表示操作不精确。通常以第二个稀释度的平板上出现50个左右菌落为好。 实验内容2：单菌落制备（细菌菌株划线纯化） 菌种保藏 试管斜面冰箱保藏 甘油管冷冻保藏（-20℃ or -80℃） 冷冻真空保藏 沙土管保藏 液氮保藏 … 实验内容3：细菌生理生化 细菌生理生化反应是菌种鉴定的重要依据 主要根据不同微生物对不同生物大分子分解利用能力、代谢途径、代谢产物不同，来达到菌种鉴定的目的 实验内容3：细菌生理生化 实验名称 实验菌种 接种方式 分工 淀粉水解 大肠 枯草 平板划线(+) 每人一皿，分别接2种菌 油脂水解 大肠 金葡 平板划线(?) 每人一皿，分别接2种菌 硫化氢产生 大肠 变形 半固体穿刺 2人一组，每人接1种菌至1支试管 柠檬酸盐 大肠 产气 斜面划线(?) 2人一组，每人接1种菌至1支试管 按下表操作，统一培养，一周后观察。 实验内容3：细菌生理生化 按下表操作，统一培养，一周后观察。 实验名称 实验菌种 接种方式 分工 葡萄糖发酵 大肠 产气 菌体一环 2人一组，每人接1种菌至1支试管 M.R.试验 大肠 产气 菌体一环 2人一组，每人接1种菌至1支试管 V.P.试验 大肠 产气 菌体一环 2人一组，每人接1种菌至1支试管 吲哚 大肠 产气 菌体一环 2人一组，每人接1种菌至1支试管 淀粉水解试验：某些细菌能够分泌淀粉酶(胞外酶)，将淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉被水解后遇碘不再变蓝色。 油脂水解试验：某些细菌能够分泌脂肪酶(胞外酶)，能将培养基中的脂肪水解为甘油和脂肪酸。所产生的脂肪酸，可通过预先加入油脂培养基中的中性红加以指示［指示范围pH6.8(红)～pH8.0(黄)］。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，培养基中比现红色斑点。 硫化氢产生试验：有些细菌能分解含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等)产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，可产生黑色硫化铅或硫化亚铁沉淀，从而可确定硫化氢的产生。 柠檬酸盐利用试验：不同细菌利用柠檬酸盐能力不同，有的细菌可利用柠檬酸盐作为碳源，有的则不能。某些细菌将柠檬酸分解为二氧化碳，培养基中由于有游离钠离子存在而形成碳酸钠，使培养基碱性增加。根据培养基中指示剂变色来判断实验结果。指示剂可用溴麝香草酚蓝(pH＜6时呈黄色，pH6～7.6呈绿色，pH7.6呈蓝色)；也可用酚红作为指示剂(pH6.3呈黄色，pH8.0呈红色)。 糖或醇发酵试验：细菌在分解糖或醇(如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甘油)的能力有很大的差异。 有些细菌发酵某种糖后产生各种有机酸(如乳酸、醋酸、甲酸、琥珀酸)及各种气体(如H2、CO2、CH4)。 有的细菌只产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来指示。在配制培养基时可预先加入溴甲酚紫［pH5(黄)～pH7(紫)］。当细菌发酵糖产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。 气体的产生可由糖发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 甲基红(M.R.)试验：某些细菌在糖代谢过程中，吸收培养基中的糖，然后分解为丙酮酸，丙酮酸再被分解为甲酸、乙酸、乳酸等。酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色而指示。甲基红的变色范围pH4.2(红色)～pH6.3(黄色)。细菌分解葡萄糖产酸，则培养液由原来的桔黄色变为红色，此为M.R.的阳性反应。 乙酰甲基甲醇(V.P.)试验：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸通过缩合和脱羧生成乙酰甲基甲醇，然后被还原成2,3-丁二醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化生成二乙酰，二乙酰可与培养基中的蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。此为V.P.试验的阳性反应。 吲哚试验：有些细菌可分解色氨酸产生吲哚，吲哚可与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。有些则不能分解色氨酸产生吲哚。 实验安排 平板菌落计数 清洗灭菌（上次结果较好的细菌培养平