6 原生质体融合育种.ppt

第1节 微生物杂交育种 概念：杂交育种通过微生物杂交将不同菌株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌株的优良特性集中于一个重组体中。 杂交育种缺陷： 只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因； 杂交进程缓慢，过程繁琐，育种时间长； 只能进行本物种或亲缘关系较近的物种杂交，不能克服远源杂交不亲和的障碍。 第2节 原生质体融合育种 原生质体:脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。 第3节 原生质体融合育种的步骤 2.原生质体的鉴定 (2)荧光染色法：原生质体混悬液用荧光增白剂（VBL）染色，洗涤后在荧光显微镜下观察，发出红色光则为完全原生质体，发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在。 （区别细胞壁与细胞膜的不同） ②酚藏花红染色法 活性原生质体能吸收酚藏花红染料而成红色，无活性的死细胞不能吸收染料呈白色;（吸收-呈色） 影响原生质体再生的因素（略） 菌体生理状态 稳定剂 酶浓度与酶作用时间 再生培养基的组成 原生质体的密度 …… （一）融合剂和融合手段 物理融合手段，电融合 细胞产生偶极化，原生质体相互粘连，细胞沿电力方向排列成串； 在外加瞬间高频直流强电压作用下，扰乱原生质体膜的分子排列，使之穿孔，然后发生原生质体膜复原过程，原生质体发生融合。 课堂活动 激光诱变育种 微波 离子束诱变、离子注入 航天 体外随机引物重组 外显子改组 酶法体外随机-定位诱变 合成改组 截断状模板重组延伸 退火低核苷酸基因重排 非依赖序列同源性的重组法 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 应用实例二 2002年在《Nature Biotechnology》上发表的另一例基因组改组的实例是乳酸杆菌耐酸菌株的选育。 通过五轮循环原生质体融合得到的新菌株适合在出发菌株不能生长的低pH值 （pH3.5）培养环境中生长和分泌乳酸，因而大大提高了乳酸杆菌合成乳酸的能力。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * (1)过滤法 根据细胞大小，选用孔径略小于细胞的砂芯漏斗，过滤。 原生质体由于外层细胞膜柔软可变形，可以由比它小的微孔中穿过，而未酶解细胞或细胞团却不能。 (2)密度梯度离心法 用蔗糖或氯化铯等制成浓度（密度）梯度溶液，由于密度差别，经离心后原生质体漂浮于上部，未酶解细胞和细胞碎片沉于溶液下部。 原生质体 细胞碎片、未酶解细胞 (3)界面法 原理：选两种不同浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。离心后原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。 原生质体 13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液 (4)漂浮法 适用于一些细胞较大的微生物。 原生质体与细胞比重不同，原生质体的比重小于细胞，能在一定浓度的溶液中漂浮在液面上，从而得到纯化。 4.原生质体的活力鉴定 分离纯化后的原生质体，用作再生或融合等育种的出发材料，必须具有活力及再生能力，因此需要进行活力鉴定。 原生质体活力鉴定方法主要有： （注意区别） ①荧光素双醋酸盐染色法 ②酚藏花红染色法 ③伊文思蓝染色法 ①荧光素双醋酸盐（FDA）染色法 FDA本身不发荧光，被细胞吸收脂解后产生具有荧光的物质。能发出荧光的原生质体具有活性；（吸收-代谢-呈色） ③伊文思蓝染色法 活性原生质体不吸附染料为无色，死的无活性细胞吸附染料呈蓝色。 （不吸收-呈色） 5.原生质体的保存 原生质体新鲜程度与其活性有关。 如果不是立即使用，则必须在低温下保存。但是保藏时间很短。 （二）原生质体再生 原生质体融合试验之前必须摸索出最佳的再生条件和完成再生实验，为融合体再生和复原做好准备。 原生质体必须重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形态，才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生质体的再生。 三、原生质体融合 （一）融合剂和融合手段 化学融合剂，普遍采用PEG介导的化学融合法。 在PEG介导融合时，通常需要一定浓度的Ca2+和Mg2+，能更有效地促进融合。 电场作用下原生质膜被击穿的过程 （二）原生质体融合过程 在高渗稳定液中，两个或两个以上凝聚成团，相邻原生质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失，细胞质融合，形成一个异核体细胞； 四、融合体再生与检出 （一）融合体再生 融合体的再生，包括融合体细胞壁合成、重建和融合体的再生。 原生质体复原后，细胞的生理和生物学特性可恢复正常状态。但一些质粒可能会脱落。 （二）融合体的检出与分离 利用营养缺陷型标记选择融合体 利用抗药性选择融合体 利用灭活原生质体检出融合体 利用荧光染色法选择融合体 利用双亲对碳源利用不同而检出融合体 √ × × A B A B