6种检测方法.ppt

高效液相色谱六种定量方法原理及使用条件 六种定量方法 1、峰面积百分比法 2、峰面积归一法 3、外标法 4、杂质检查法 5、内标法 加校正因子的主成分自身对照法 不加校正因子的主成分自身对照法 峰面积百分比法 按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。 某化合物百分含量（%）= 简单的说就是配制溶液，进样，按峰面积百分比法读取含量。一般系统适应性主要考察分离度。（如：双乙酰阿昔洛韦。D-NAP方法，P4） 峰面积 Σ峰面积 ×100% 优点： 快速、简单、无需考察系统重复性（进样量不严格）无需对照品 缺点： 测定误差大，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。 峰面积百分比法 峰面积归一法 在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液（一般为100%限度加样溶液），进样，记录色谱图，按 式中：Ci—加样溶液中加入的杂质百分含量； Ai1—回收异丙醇中杂质的平均峰面积； Ai2—加样溶液中杂质的峰面积； Cs—加样溶液中主成份的百分含量； As—加样溶液中主成份的峰面积。 计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常定位或以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。 峰面积归一法 按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积，加入校正因子计算各组分面积及总峰面积。计算各组分折算后峰面积占总峰面积的百分比。 公式如下： 某化合物百分含量（%）= 比面积百分比法多了一步校正因子计算。如双乙酰阿昔洛韦。 若杂质含量较少，乘校正因子对总面积影响较小，可按结果×校正因子报告。 若杂质含量较大或个数较多，乘校正因子对总面积影响较大，需按峰面积乘校正因子重新计算总峰面积后再计算。（如：vcv 有关物质2等） 峰面积×响应因子 Σ峰面积×响应因子 ×100% 优点： 快速、简单、无需考察系统重复性（进样量不严格）验证时需对照品，之后无需对照品。 缺点： 同峰面积百分比法。误差较大， 但比百分比法准确。 峰面积归一化法 外标法 建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量： 含量（% ）=（CR/CX）(AX/AR)*100 式中CR——对照溶液中待测组分浓度； CX——供试品溶液中待测组分浓度； AX ——供试品溶液中待测组分浓度； AR ——对照溶液待测组分峰面积。 系统适应性中需考察重复性。 基本原理：浓度和峰响应成线性。（如各产品项下含量方法，CPG BSA杂质A、基因毒性杂质等） 外标法 优点： 外标法方法相对内标法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量准确。对照品好找，用待测组分的纯品作为对照品。 不足： 1、进样量必须准确。此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时，以定量环或自动进样器进样为好。 2、仪器及人员精密度要求较高。需控制实验条件稳定性。 3、定期校正。 4、只能每个待测组分均需进其对照溶液。 但此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。 杂质检查法 1、 加校正因子的主成分自身对照法 已知且有对照品杂质 2、不加校正因子的主成分自身对照法 未知或无对照品杂质 已知杂质且有对照品的我们现在都加校正因子，未知杂质按1.0计。 除另有规定外，校正因子大于等于1.0时，保留至小数点后1位，反之，保留至小数点后两位；结果为0.80~1.2之间，通常按1.0计，反之，杂质浓度计算时，应乘以测试得到的校正因子。 加校正因子的主成分自身对照法 在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校