6章DNA重组和克隆.ppt

RuvC bound to Holliday junction Antibodies are Proteins that Recognize Specific Antigens The structure of the Ac autonomous transposable element of corn and of  several Ds nonautonomous elements derived from Ac The Ty transposable element of yeast ?噬菌体 (三)目的基因? 目的基因：用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA(target DNA)。 类型： cDNA(complementary DNA)：指经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA，经聚合可合成双链cDNA。 基因组DNA(genetic DNA)：指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 大容量载体 柯斯质粒载体 酵母人工染色体载体 质粒  （1） pBR322 　　pBR322是由几个质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的克隆载体，分子的长度为4 363bp，具有氨苄青霉素抗性基因(ampr)和四环素抗性基因(tetr)。pBR322共有24种限制酶的单一识别位点，其中7种酶(ecoRV, NheI, BamHI, sphI, salI, XmaⅢ, Nru I)的识别位点位于四环素抗性基因内部，2种酶(ClaI, HindⅢ)的识别位点在这个基因的启动子内部。所以在这9个限制性位点上插入外源DNA通常都会导致tetr的失活。3种酶(scaI, PvuI, PstI)在ampr内具单一的识别位点，在这3个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活 （2） pUC18/pUC19 pUC载体系列是由大肠杆菌pBR322质粒与M13噬菌体构建而成的双链DNA质粒载体，含有来自pBR322质粒的复制起点(ori)，氨苄青霉素抗性基因(ampr)以及大肠杆菌β半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码α肽链的基因，在lacZ基因中有一个多克隆位点(MCS)区段。当外源的DNA片段插入到这些克隆位点使α互补链破坏时，形成的是无活性的β-半乳糖苷酶，被转化的大肠杆菌细胞，在Xgal-IPTG培养基上形成白色菌落，而没有外源DNA插入的质粒转化大肠杆菌细胞时，在Xgal-IPTG培养基上形成蓝色菌落。这 一系统中的Xgal(5溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)可被β-半乳糖苷酶水解生成深兰色的5-溴-4-靛兰，IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)可诱导β-半乳糖苷酶α-链的合成。pUC质粒载体比pBR322具有更小的Mr，而且由于rop基因的缺失(其基因产物ROP蛋白，控制质粒复制)，使得其拷贝数大增，每个细胞可达500～700个拷贝，因此由pUC质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。pUC18和pUC19的唯一差别是多克隆位点的方向相反。 A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR 结构区 重组区 调控区 裂解区 cos位点 cos 位点 A R A R EcoRI 目的基因 EcoRI EcoRI 插入型 置换型 特点： GIY-YIG endonuclease domain a reverse transcriptase domain with similarity to telomerases and group II introns. 另一类TP逆转录转座子为Penelope样TP逆转录转座子，编码一种在可移动内含子中也存在的内切核酸酶，也通过靶序列引物机制进行转座 　　LINE分为LINE-1(简称为L1)和LINE-2(简称为L2)两种形式，人LINE的主要是L1。完整的L1全长为6.5 kb，含有2个开放阅读框，一个相当于gag基因，编码一种DNA结合蛋白，另一个编码逆转录酶。然而，人类基因组中具有转录和翻译活性的完整的L1大概只有50多个，绝大多数都是长度不等的缺失性变体，丧失了有功能的基因。由于Ll-DNA的转录终止并不总是精确的，有时通读，有时提前结束，结果导致一些转录产物被加长或截短，这就是Ll序列大小不均一的原因，被截短的L1很可能丧失了某些功能。 　　 LINEs (long interspersed repetitive elements) 6kb in humans Encod