CAR-T文献解读-Carl June-2011.docx

Carl June，2011，NEJM 摘要： 我们设计了一种慢病毒载体表达特异性识别B细胞表面抗原CD19的，与CD137（T细胞的一个共刺激受体[4-1BB]）和CD3ζ（T细胞抗原受体的一个信号转导原件）偶联的嵌合抗原受体。低剂量（大约1.5×105细胞/Kg体重）的自体嵌合抗原受体修饰的T细胞灌输到一个患有难治性慢性淋巴细胞白血病（CLL）的患者体内，T细胞在体内扩增到了初始灌输剂量的1000多倍，同时慢慢的有了溶瘤反应到最后完全缓解。除了溶瘤反应之外，嵌合抗原受体T细胞唯一的3级/4级毒性反应就是淋巴球减少症。这些基因工程细胞在血液和骨髓中的高含量持续了半年之久。一个特异性的免疫反应在骨髓中被检测到，伴随着表达CD19的B细胞的消失，包括正常B细胞和白血病细胞。治疗之后，癌症缓解保持了10个月。低丙球蛋白血症是一个预期的慢性毒性反应。 正文： 随着基因转移技术的使用，T细胞能被改造得使其表面稳定的表达抗原特异性的抗体。嵌合抗原受体是将某种抗体的抗原识别域和一个胞内信号域CD3ζ链或FcεRIγ链连接起来。虽然嵌合抗原受体能像内源性的T细胞一样被激活，嵌合抗原受体T细胞在体内如何扩增以及在体内会失去临床活性是限制这种技术走向临床的最大障碍。嵌合抗原受体介导T细胞的反应可以通过添加一个共刺激域而大大加强。在临床试验模型中，我们发现包含CD137（4-1BB）的信号域的CAR-T细胞和只包含CD3ζ的CAR-T细胞相比，其抗肿瘤的活性和体内的持续时间都大大加强。 对于大多数肿瘤而言，肿瘤特异性抗原的靶位点不容易获得，但是对于B细胞瘤而言，CD19是一个非常有吸引力的靶位点。CD19限制性表达在正常和恶性B细胞，以及前B细胞中。我们开展了一项关于表达抗CD19的嵌合抗原受体自体T细胞（CART19）的先导临床试验，3个病人被治疗。这里我们主要报道一个晚期，p53缺陷的慢性淋巴细胞白血病（CLL）人在进行T细胞治疗之后，体内的免疫和临床反应。 例子介绍： 这个病人在1996年诊断出了I期CLL，6年之后，他才首次因为越来越严重的白细胞增多和淋巴结肿大接受治疗。2002年，他接受了2轮利妥昔单抗和氟达拉滨联用治疗，这个治疗使得血细胞计数回归正常，以及淋巴结肿大部分缓解。2006年，因为病情的加重，他接受了4轮利妥昔单抗和氟达拉滨联用治疗，再一次，血细胞计数回归正常，以及淋巴结肿大部分缓解。这次治疗之后，病人经过了20个月的病情停滞阶段以及2年的无治疗阶段。2009年2月，他有了急剧的白细胞增多和复发的淋巴结肿大，慢性白血病细胞已经广泛的渗透进了他的骨髓。细胞遗传学分析显示，每15个细胞中，有3个存在着17号染色体的缺失，荧光原位杂交结果显示，200个细胞中有170个有17号染色体和TP53的缺失。他接受了利妥昔单抗和苯达莫司汀联用治疗了一个疗程，以及3个疗程单独的苯达莫司汀，没有利妥昔单抗（因为严重的过敏反应）。这次治疗只导致了淋巴球过多症的暂时缓解。越来越严重的淋巴结肿大通过治疗后的CT扫描结果显示出来。 2009年12月，自体T细胞通过白细胞去除法和冷冻保存获得。病人接受了11周的阿仑单抗（一种抗CD52的抗体，CD52是一种成熟的淋巴细胞表面抗原）治疗，造血功能有了改善，淋巴结肿大也有了部分缓解。接下来的6个月，病人肿大的淋巴结持续，广泛的扩散到了骨髓中，到处都是1到3cm的淋巴结。2010年7月，病人注册参加嵌合抗原受体修饰的T细胞疗法的I期临床试验。 实验方法： 实验设计： 试验（ClinicalTrials.gov，序列号NC设计来证明自体CART19 T细胞灌输在复发性和难治性B细胞瘤上的安全性和可行性。试验得到了宾夕法尼亚大学审核委员会的批准。试验按照本文的流程进行。本次试验没有商业赞助。 实验流程： 我们设计了一个自身灭活的慢病毒载体（GeMCRIS 0607-793），这个载体在之前的报道中，已经经过了临床前的安全性检查。T细胞制备的方法也是之前就有报道的。通过对血液和骨髓样本进行PCR分析来检测嵌合抗原受体T细胞。通过标准曲线获得了定量的下限，定量下限的平均值我们认为是含量的近似值。实验定量的下限是每微克基因组DNA有25个拷贝。 对血清进行了溶解因子分析，这些血清从血浆和骨髓中得到，并且按照单次使用量分成一份份的，用-80℃储存。溶解的细胞因子定量实验通过使用Luminex的微珠芯片技术和Life Technologies的试剂来测定。 用来转染病人T细胞的慢病毒载体。一个临床级的假病毒包括疱疹性口腔炎病毒G蛋白（pELPs 19-BB-z），直接表达鼠单克隆抗体FMC63的抗CD19 scFv，人CD8α铰链和跨膜区，人4-1BB和CD3ζ信号传导区。CAR19的详细信息，显示在图片