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CRISPR/Cas9 Timeline of genome engineering research CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9是细菌和古生菌一种特殊的防御系统，能够有效地抵抗噬菌体和外界各种基因元件（如质粒）对其造成的干扰。 Type II 基因座 以产脓链球菌的典型Type II CRISPR/Cas为例，其基因座结构可分别三部分， 5 端为 tracrRNA 基因。 中间为一系列 Cas蛋白编码基因，包括 Cas9、 Cas1、 Cas2 和Csn2。 3 端为 CRISPR 基因座，由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(repeats)顺序排列组成。 Cas9 protein function Cas nuclease has: ①RNA binding domain; ②an α-helical recognition lobe; ③a PAM-interacting site. ④a nuclease lobe: NHN：负责切割与crRNA互补的链 RuvC：负责非互补链的切割 因此，将 RuvC 或是 NHN 活性突变后Cas9只有单链切割活性，类似于切口酶 Adaptive immunity involves three phases（作用机理） （1）CRISPR的高度可变的间隔区的获得：外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段 DNA序列(protospacer)被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于 CRRSPR 的 5 端的两个重复序列之间(repeats)。 （2）CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)：CRISPR基因座首先被转录成前体 CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后由 tracrRNA指导，在 Cas 蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的 RNA 单元，这些小RNA 即为成熟crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成． （3）CRISPR/Cas系统发挥活性，对外源遗传物质的干扰：成熟的 crRNA 与特异的 Cas 蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源 DNA 结合并扫描到外源 DNA，寻找其上的靶序列，crRNA 的间隔序列与靶序列互补配对，外源 DNA 在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割。 PAM(protospacer-adjacent motif) PAM是由3个成对碱基构成的序列，靠近靶DNA序列3’末端，可以促进靶序列的识别。 化脓链球菌Cas9作为基因组修饰通用的工具，特异识别NGG和NAG的PAM序列（前者效率更高）。 RNA-DNA异源双链体的形成是从PAM位点开始的，从而使得Cas9发挥活性，对DNA链进行切割。 避免细菌自身免疫的发生 宿主菌利用 crRNA 与靶序列配对结合介导外源DNA切割，而crRNA本身是由宿主菌的基因组为模板转录出的 pre-crRNA 经加工后形成的，这就是说相同的靶序列也存在于宿主的基因组中，那么 CRISPR/Cas系统应该有一套机制将自身序列和外源的靶序列区分开。 宿主菌的 CRISPR 基因座位的间隔序列(spacer)临近位置不存在 PAM，而靶序列临近有PAM，在PAM序列crRNA不能配对，只有不完全的配对才允许核糖核蛋白复合体发挥切割活性，，通过这样的机制CRISPR/Cas 系统避免自我免疫。 Use of CRISPR/Cas9 for genome editing tracrRNA:crRNA改造成一条嵌合的sgRNA，发挥 tracrRNA和 crRNA的功能，包括两部分： ?DNA互补序列（一般20核苷酸），相当于crRNA； ?双链结构，可以结合Cas9，相当于tracrRNA。 在sgRNA指导下，Cas9内切酶对特定位点的DNA进行切割，产生DSB，然后细胞会借助同源定向修复（HDR）或者非同源末端连接机制（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。 对于HDR，当提供同源模板，可产生精确的序列修饰，插入特定序列； 对于NHEJ，可以导致插入或缺失 Off-target effect Off-target effect : the tolerance of Cas9 to mismatches in the sgRNA sequence. 脱靶效应与诸多因素有关，如sgRNA自身的特征、浓度及其与Cas9的相对量等。 CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于sgRNA与靠近PAM(NGG)处10-12bp碱基（seed sequence）的配对，其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响较小，而我