CRISPR-Cas.ppt

局限性： CRISPR/Cas9对目的序列的识别与结合必须有PAM的存在。这就使得该系统对基因组的靶向识别位点被限制在平均每 8 个碱基一个位点。 问题 CRISPR/Cas9 来源于细菌，它是否会对哺乳动物细胞或个体产生毒性或是否会诱发哺乳动物细胞或个体的免疫反应？ CRISPR/Cas系统是依赖ＤＮＡ复制或者转录过程将ＤＮＡ解螺旋还是本身就具有ＤＮＡ解旋能力？ CRISPR/Cas9 系统如何导入受体并保证CRISPR系统的组份能准确地到达 DNA 靶序列？ 如何突破PAM序列的限制、如何建立对Cas9特异性(脱靶效应) 的全面评价体系、如何构建不同物种中可通用的Cas9与sgRNA 导入与表达系统以及如何更有效的激活同源重组修复等。 7 提高打靶特异性的策略 降低sgRNA 与Cas9 的浓度。这一方法的效果还有待讨论。有研究表明该方法可显著降低脱靶突变/打靶突变的比例，但也有研究称该方法将同时降低脱靶突变与打靶突变的发生。 利用Cas9 的切口酶突变体产生DNA单链断裂。因为与DNA 双链断裂相比，DNA 单链断裂将诱导保真性更高的碱基切除修复。 麻省理工学院张峰实验室的一种提高CRISPR/Cas系统特异性的新思路。他们开创性的提出，将突变的只能在双链DNA上形成缺口的Cas9n蛋白（Cas9n为D10A突变的突变体，只能切割与sgRNA直接互补的DNA单链）配对使用，同时切割双链DNA的正负链，形成５′端突出的双链缺口。这一方法可以降低脱靶率50～1500倍，同时不影响基因敲除效率。 8 小结 设计和构建方法简单快捷，成本低廉。 基因编辑效率优于ＺＦＮｓ和ＴＡＬＥＮｓ系统。 可同时实现多个基因的打靶。 可以方便快捷的改造为基因表达调控工具。 CRISPR/Cas9系统及其应用 CRISPR-Cas系统简介 CRISPR-Cas系统作用机理 CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建 载体构建、导入目的生物或细胞系、筛选 CRISPR-Cas9系统的应用 CRISPR-Cas9系统的不足之处 提高打靶特异性的策略 小结 1 CRISPR-Cas系统简介 1.1 CRISPR-Cas系统的来源 成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于细菌与古细菌中的，由 RNA介导的、可遗传的获得性免疫系统。 1.2 CRISPR-Cas系统的研究历史 1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。 2007 年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入侵；2008 年，Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能 2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。同年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定点插入。 1.3 CRISPR-Cas系统的结构 CRISPR-CAS系统的组成主要包括:由不连续的重复序列R(repeat)与长度相似的间区序列S( spacers)间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L(leader) 以及一系CRISPR相关蛋白基因cas。 1.4 CRISPR-Cas系统的类型 CRISPR/Cas系统有3 种类型，其中，产脓链球菌的TypeⅡ型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞、小鼠、斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰，目前被广泛应用于真核细胞的基因组编辑中。 Ⅱ型CRISPR/Cas系统包含3个主要基因位点:编码相关蛋白的位点（Cas9、Cas1、Cas2、Csn2），编码含重复片段的小RNA位点（CRISPR位点）和1个辅助小片段RNA(tracrRNA位点)。 2 CRISPR-CAS 系统的作用机理 2.1 适应：间隔序列的获得 当外源DNA片段入侵后，CRISPR/Cas识别入侵的核酸和扫