ELISA实验 PPT.pptx

PowerPoint Template;;;;;ELISA类别;双抗体夹心法; 除了以上常见的4种检测方法外，还有直接法、捕获包被法、竞争法（测抗体）、ABS-ELISA法等其他方法。;ELISA实验过程主要分以下三步：;第三：实验操作（以双抗体夹心法为例） 1. 包被（在聚苯乙烯板上包被特异性已知抗体，使之与板结合） 4℃过夜（大于12小时）或37℃孵育 2小时，包被后洗涤一次； 2. 封闭（一般使用0.1~2%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清等）37℃反应2小时（封闭 液体积要大于包被液体积），封闭后清洗3次； 3. 加入含有待测抗原的样品，37℃孵育1小时； 4. 洗涤，清洗3次； 5. 加入酶标液（酶标二抗），37℃孵育1小时； 6. 洗涤，清洗5次； 7. 加入酶促反应底物，发生显色反应（37℃避光显色5~15min)，终止显色后测量450/630nm吸光值。 注：上面实验共12次清洗，清洗次数可适当增多，同一反应尽量保证使用同一种清洗液，常见清洗液有PBST、TBST、PBS等。 ;结果判定;实验中使用的试剂、仪器;常见仪器;实验中遇到常见问题与解决方法;1.阴性对照出现阳性结果： 　造成该现象的原因有4个： 1）试剂或样品可能被污染，或者由于孔之间的溅洒出现交叉污染。 ——应当更换使用试剂，小心操作； 2）酶标板洗板不彻底。 ——尝试用洗液充满板孔确保每孔被充分洗涤，洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净； 3）抗体量过多导致非特异结合。 ——应该根据推荐用量使用抗体，尽量使用较少的抗体； 4）夹心法、捕获法中检测抗体与包被抗体/抗原反应。 ——确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体，两者之间不会互相反应。;2.酶标板整体背景高 　　　造成该现象的原因有4个： 1）抗体非特异性结合。 ——应确保进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液，最好使用5%~10%的与二抗同种动物来源的血清或牛血清，确保板孔经过预处理以防止非特异结合，使用亲和力强、纯度高的抗体，最好经过了预吸收处理； 2）底物结合浓度过高或反应时间过长。 ——应调整底物的浓度，当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应，适当缩短显色时间； 3）底物溶液不新鲜或被污染。 ——应检测底物溶液，正常的底物溶液应该是清亮透明的，如果变黄或其他颜色则是被污染的标志； 4）底物孵育过程没有避光。 ——底物孵育应该在避光环境下进行。;3.吸光度数值偏高或偏低 　　　造成的该现象的原因有几个： 1）样品中待检抗原含量太低会导致测试结果偏低。 ——可尝试增加样品的使用量或者更换一个检测更灵敏的方法； 2）加入抗体量不合适也会造成结果偏低或偏高 ——应确定使用的是建议抗体用量，或者为了使结果更好尽可能调整抗体的最适用量； 3）孵育时间不够长会导致检测结果偏低。 ——应适当延长抗体或抗原的孵育时间，确保待测样品与检测抗体能充分结合； 4）孵育温度不适合。 ——应保证抗体在最适宜并且稳定的温度下孵育，一般是室温（25℃孵育2h或37℃孵育1h）。;影响因素的分析;1.标本的影响 1.1 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性 可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使H2O2释放出原生态氧(O)，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性。所以严重溶血标本禁用。 1.2 标本受细菌污染 ：因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。 1.3 标本保存不当 ：在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5d内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。 ;1.4 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性 最好使用真空采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。 1.5 标本凝固不全在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。 2.试剂影响