EMSA实验.ppt

电泳迁移率实验技术（EMSA） 主讲人：刘东 凝胶迁移实验又称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核酸相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用于蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。 一、实验原理 EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发生互作。 二、实验操作步骤  1、实验前准备 （1）合理的实验方案 根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。 （2）样本制备 可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。 （3）探针制备 根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。 蛋白样本（2-5μg） Xμl poly d(I-C) 1μl Binding Buffer 2μl Nuclease-Free ddH2O Xμl 总体积 9μl 2、形成蛋白-探针复合物  （1）在0.5ml离心管中按顺序将下列组份混匀：  （2）冰浴5min后，加入1μl探针。（对照组加1ul对照探针） （3）PCR仪中室温（20-23℃）温育30min。 3、制备凝胶，电泳（1） 必须是非变性PAGE凝胶,一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果。 (2）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中120V预电泳10min，电泳完毕后冲洗加样孔。 （3）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。 （4）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中， 恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。（大约50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长） 10XTBE 1.0ml 40%Acrylamide(聚丙烯酰氨) 3.3ml deionized,sterilewater 14.8ml 50%Glycerol（甘油） 1.0ml TEMED（四甲基乙二胺） 10μl 脱气10min 10%AP （过硫酸铵） 120μl 4、转膜 （1）在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。 （2） 按如下顺序组装“三明治”：纤维垫，滤纸，凝胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确保凝胶位于阴极、膜位于阳极。 （3）在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。（注意根据实际情况调整电压及时间）。 5、紫外交联 紫外交联仪是一种多用途的254mm紫外辐射系统主要用于将核酸交为使核苷酸固定在杂交膜上。传统的方法是将膜置于80℃真空烘箱中烘2小时，在本紫外交联仪上仅需在254nm紫外光下照射几秒钟即可。 · 紫外照射可使杂交信号比 传统烘烤法提高5-10倍。 5.洗涤、孵育 用Washing Buffer洗涤(整个过程避免膜干燥) 倒掉冲洗缓冲液，加入Block Buffer轻微震荡20min 加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上） 去掉酶联物稀释液，用Washing Buffer洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0min。 配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，使底物均匀覆盖，注意不要产生气泡） 6、曝光成像 两种方法: 化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像 用TNFa刺激肿瘤细胞后得到的核蛋白的NFKB的EMSA试验图片 操作基本和Western 试验操作相当, 只是这个膜是一次性的,不能重复使用, 一定保存好图片!由于跑得是非变性凝胶,蛋白保持天然构像和活性,所以条带很可能是一块一块的而不像WB那样很规整的一条细线,这个很正常。 三、常见问题 1、为什么看不到迁移带？ 1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。 2）样本中没有可以与探针结