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Eph B Receptors Regulate Stem/Progenitor Cell Proliferation, Migration, and Polarity during Hippocampal Neurogenesis 摘 要 成年大脑保持有两个神经发生的部位，在该部位新的神经元生成，迁移到它们适当的位置并整合到CNS中。其中一个就是海马齿状回的颗粒下层区（SGZ）。 本研究结果显示：缺乏EphB1，甚至是同时缺乏EphB1和EphB2的小鼠，海马的神经祖细胞数量显著减少。此外，在神经发生的其他方面，比如极性，细胞定位，增殖等，缺乏EphB1受体或它同源的ephrin-B3配体的动物这些过程都受阻。本研究还揭示了在海马区EphB1 和ephrin-B3共同调节神经祖细胞的增殖和迁移。 这可以作为神经变性疾病或脑损伤治疗中对新生神经元的产生、整合调节的一个靶标。 材料与方法 小鼠： EphB1、EphB2、Ephrin-B3突变型动物，nestin-eGFP转基因动物，均为CD1品系。 免疫组化和免疫荧光： 8-10周的成年小鼠，麻醉，4%PFA灌注并固定过夜，振动切片（40μm）4℃保存于1%PFA。每个动物选择齿状回4-6个同位置的切片做免疫组化。GFP、Ki-67、DCX、β-gal、PSA-NCAM、NeuN一抗孵育，4℃过夜；Cy2,Cy3或Cy5结合的驴二抗孵育4℃过夜。Toto-3标记DNA。 X-gal染色：从CO2窒息的动物分离新鲜脑组织，切片后固定于4%PFA中，在X-gal溶液中37 ℃共孵育过夜，核固红复染。（ β-gal +） 视网膜蛋白和ephrin-B3双标表达：4%PFA灌注的ephrin-B3 lacZ /lacZ动物脑组织振动切片，漂洗，在X-gal中过夜处理，用来检测ephrin-B3- β-gal融合蛋白。洗掉多余的X-gal，切片在4%PFA中后固定15min，漂洗，免疫组化处理，DAB显色标记齿状回中的视网膜蛋白。 Brdu的注射：单次的腹腔注射（150mg/kg）或者是每隔2h（50mg/kg）连续注射3次用来研究齿状回的增殖。 Brdu用PBS溶解，浓度10mg/ml。单次注射，注射后2h处死；多次注射，各组动物分别在注射后2h、24h或7、14、28天处死。 细胞计数：海马齿状回区域30μm切片GFP+、Brdu+或Ki-67+细胞。 树突计数：同样的海马齿状回区域DCX免疫标记后30μm切片，三 维计数DCX+树突，激光共聚焦采集图像。 齿状回体积的测定：每第五个振动切片（40 μm ）尼氏染色，用相关软件公式进行评估，对比野生型和EphB突变型的平均体积。 荧光激活细胞分选：动物出生后7d和14d用氯胺酮处死，取海马，海马的每个侧面都切成垂直于长轴的切片（500 μm），切片置于含10%FCS的DMEM/F-12 培养基中，取齿状回部位，用木瓜蛋白酶消化分离，用含10%FCS的DMEM/F-12 培养基重悬细胞，悬液加入鼠抗-PSA-NCAM，二抗用Cy5标记，悬液通过70 μm细胞滤器，细胞群的分析用流式。（移行） RNA的提取和反转录-PCR:从FACS分选的细胞群中分离总RNA，先合成cDNA，加入引物（ EphB1、EphB2、ephrin-B3、GAPDH、GFP ）进行PCR扩增。 结果 EphB1在成年齿状回神经干细胞和祖细胞中的表达 齿状回EphB1的表达：4周龄EphB1 lacZ /+突变小鼠脑切片与X-gal染色检测SGZ区β-gal报告基因敲入的表达。（ 已证实，EphB1 lacZ /+突变小鼠能用细胞质的β-gal正常表达EphB1） 8-10周龄成年齿状回，nestin-eGFP 转基因小鼠，鉴别SGZ区 Ι型（绿色）Ⅱa型（红色)干细胞/祖细胞和GL成熟神经元（蓝色）。 在SGZ区新的神经元的诞生从nestin+共表达神经胶质细胞标记物GFAP Ι型干细胞，到祖细胞共表达nestin和DCX（ Ⅱa型），到祖细胞只表达DCX（ Ⅱb型），到最后成熟神经元表达NeuN标记物。 为了更好的表现EphB1在SGZ区的表达，在选择性nestin启动子元件的控制下，用转基因小鼠表达eGFP。 Nestin-eGFP转基因用来标记成年SGZ区早期干细胞/祖细胞群。 EphB1 lacZ /+动物用抗β-gal和抗DCX双标实验：鉴定了大部分表达EphB1 的细胞是DCX+ Ⅱa型和Ⅱb型神经元祖细胞(c)。 细胞表面NCAM上PSA的修饰与DCX的表达完全重叠(d) 。 2周龄的小鼠对三种不同类型的神经干细胞/祖细胞用FACS进行分选。从分选出的不同细胞群中分离总RN