植物基因组总DNA的提取.ppt

实验八 植物基因组总DNA的分离----CTAB法 一、实验目的 1、了解DNA分离的原理与方法； 2、掌握CTAB法分离植物DNA的方法与技术。 二、实验原理 分离动植物、微生物等的DNA是分子遗传学的基本操作，是进行基因组DNA序列分析、遗传标记分析、基因克隆、基因定位等的基本步骤。 一个好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：①所得DNA的纯度应满足下游操作的要求，如用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物；②所得DNA应当完整，电泳检查时给出精确性高、重复性好的迁移带型；③所得DNA应有足够的量，以满足不同的研究目的。 不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。例如，在构建用于筛选基因组DNA文库时，需要使用高相对分子质量、高纯度的DNA；而在进行遗传标记分析时，对DNA纯度的要求就可以低一些，但其他要求如DNA的产量则显得更为重要了。 DNA的提取程序应包括以下几个主要步骤： 首先，对植物细胞来说，必须破碎（或消化）细胞壁，释放出细胞内容物。常用的破壁方法是将植物幼嫩组织在液氮中快速冷冻后，研磨成细粉。动物组织块也可用此方法。 其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子----镁离子，保护DNA免受内源核酸酶的降解。 最后采用化学或酶学的方法去除蛋白质、RNA以及其他大分子。细胞内DNA与蛋白质相结合，而蛋白质对DNA的操作会产生影响，因此需要去除染色体上的蛋白质。一般采用苯酚/氯仿抽提的方法。因为苯酚/氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响，经苯酚/氯仿抽提后，蛋白质变性而沉淀到有机相与水相的界面，DNA仍留在水相中。将含有DNA的水相转移出来，利用乙醇或异丙醇沉淀DNA，即可把DNA回收出来。提取的DNA是粗制品，仍含有少量蛋白质和RNA杂质，可分别用蛋白酶、RNA酶分别去除。 本实验通过研磨植物幼嫩叶片，利用CTAB提取液裂解细胞。CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂, 在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂(氯仿：异戊醇)抽提，使水相的核酸与蛋白质分开。在上清液中加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。 三、仪器与材料 材料：小麦幼苗（最好是黄化苗）。 试剂： DNA提取液（NaCl 1.4M，CTAB（w/v） 2％，Tris·Cl 100mM，EDTA 20mM，巯基乙醇 0.2％，PVP(聚乙烯吡咯烷酮) ）、液氮、氯仿:异戊醇=24:1、酒精等。 器具：水浴锅、离心机、研钵、离心管、药勺等。 四、实验程序 （1）研磨。在预冷条件下将叶片处理，并提前将研钵冷处理，将液氮倒入盛放叶子的研钵，待叶片变为灰色时迅速研磨成粉末。 （2）将粉末迅速加入试管，加入已预热的CTAB混合液，在65°水浴锅内保温30分钟，每隔10分钟上下摇动试管一次。 （3）向上述试管中加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)，颠倒混匀，摇晃10分钟。然后离心10分钟，5000r/min。 （4）取上清，上清液中加入2倍体积-20oC无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇上下摇晃，使DNA充分沉淀，-20oC放置30-60分钟。 （5）5000r/min离心4-5分钟。弃上清。所得DNA用75%乙醇洗两遍。抽干或自然晾干。 （6）加TE或ddH2O溶解。 [实验注意事项]： 本实验的关键之一就是培养幼嫩的黄化苗，能更容易获得较多的DNA；在研磨材料时，动作要迅速，防止粉末液化；最后，离心后吸取上清液时要小心，只吸取上清液。 [作业] ： 1、基因组DNA与质粒DNA的分离有何区别? 2、如何防止提取过程中DNA降解、DNA污染等？ * *