循环肿瘤细胞宋望方案.pptx

KRAS and BRAF mutation status in circulating colorectal tumor cells and their correlation with primary and metastatic tumor tissue;所有结直肠癌病人中有30-40%的人KRAS突变，且抗EGFR靶向药物只对野生型KRAS病人有效，对突变型无效。 BRAF基因的突变与否和靶向药物的效用也应该是有关的，只是目前的证据比较少。 原发灶和转移灶的肿瘤细胞基因会随着时间推移和治疗发生变化。 在病人进行靶向药物治疗前和治疗过程中，应该及时的进行肿瘤基因的检查，从而来调整治疗方案。 现在的基因检测都是通过组织活检，这种方法获取难度大，损伤大，不适合反复多次检查。所以尝试用CTCs来检测基因。 ;患者：63名肝转移性结直肠癌者（经筛选后为43名)，每人2*30ml静脉血（在肝手术前）；原发灶和转移灶的新鲜冷冻组织（FF）或福尔马林固定后石蜡包埋的组织（FFPE）。 癌细胞系和人工合成DNA：结直肠癌细胞系HCT116（杂合子G13D,GA KRAS突变），乳腺癌细胞系SK-BR-3（KRAS和BRAF野生型）。EntroGen kit 提供的一系列浓度的KRAS突变型人工DNA样本。 CellSearch系统：用于CTCs的富集、分离、计数。 Fast COLD-PCR and Surveyor/WAVE technology EntroGen KRAS/BRAF kit ASB-PCR assay TOPO TA cloning and Sanger sequencing;技术路线;;原发灶和转移灶组织活检都有的一共43人，排除20人（原发灶还没有手术切除，肝肿瘤是良性的或者不是大肠癌的转移灶。） 43人中有CTC计数和分离的只有42人。（1人数据丢失） CTC计数的中位数是1（范围（0-37）；16名患者没有检测到CTCs（38%） 大部分患者是肝转移，6个患者也有其他部位转移（大部分是肺部），21个患者在肝手术前做过化疗，15个患者为原发灶做过新辅助或辅助治疗。 ;;;原发灶： 9个KRAS突变（21%）只有1个是T35I基因突变，其余都是12or13突变 3个BRAF基因突变，2个是V600E，1个是D594G。 没有KRAS和BRAF同时突变。 转移灶： 10个KRAS突变（23%），全是12or13突变 4个BRAF突变（9%），2个V600E，1个D594N，D594G。 没有KRAS和BRAF同时突变。 两者关系： 9个原发灶KRAS突变中，4个转移灶与原发灶突变一致，4个为野生型，1个转移灶为其他突变。 34个KRAS野生型中，5个转移灶有突变（1个同时性转移，都术前化疗） 3个原发灶BRAF突变中，2个转移灶有相同突变，1个为野生型。 40个野生型BRAF原发灶，2个转移灶有突变（1个同时性，都术前化疗） 唯一有过单抗治疗的是CTC203;;选了13个样本，包含高和低的CTC计数，突变和野生型的转移灶。 只有CTC208样本的KRAS G12D GA突变。其原发灶没突变，但转移灶有同样的突变。5个样本没有PCR产物，另5个组织中有突变的样本，CTC中没发现突变。 ;首先用一系列浓度KRAS突变DNA的样本来测试其检测的极限。测出来极限为0.6%（表4） 然后检测了9个样本，8个在原发灶或转移灶中有突变，然而没有一个突变被检测出来。 ;;先用一系列浓度的KRAS突变DNA测试其检测的极限。最少为0.2%的时候能测出，测7个基因的时候最少为0.6%。 只用了样本的40%进行检测 对所有的RNA进行了检测，5个KRAS基因突变被检测出来（0.01-0.89%），其CTC计数2-37。 4个患者的转移灶有相同的基因突变，但CTC284的原发灶和转移灶都是野生型。 CTC196检测出BRAF V600E，但其转移灶为野生型。（对BRAF只能测V600E） 用Sanger sequencing测序验证CTC基因突变的情况（CTC245）。 ;CTC检测的困难：CTC数量太少，缺乏有效的放大机制，有大量的白细胞混杂。 ASB-PCR对CTC的检测效果最好。 原发灶和转移灶的基因不一致性是客观存在的，在本试验中KRAS中为23%，在BRAF中为7%。 有可能是突变型和野生型的肿瘤细胞在一个肿瘤组织内共生导致的不一致性。