ABCA1启动子区序列2概述.docx

ABCA1启动子克隆及其活性的分析 立项的必要性及国内外研究现状和发展趋势 1.1立项的必要性 基因表达调控是一个多层次的复杂过程，其中转录水平的调控是最重要、最复杂的环节。转录起始水平的调节机制则是基因表达的基本控制点。启动子是转录激活过程起发动作用的特异DNA 序列，与转录因子结合后调节基因的转录。所以对ABCA1启动子的研究尤为重要。荧光素酶报告基因载体不含启动子及增强子，将目的基因调控序列克隆到含有报告基因的表达质粒，荧光素酶的表达受重组质粒上游启动子序列的调节。重组质粒转染适当的细胞系荧光素酶活性可直接反映启动子的强度。目前，这用研究方法已经被广泛应用。本研究将ABCA1启动子克隆到荧光素酶报告基因载体，该载体将成为ABCA1转录调控研究的有效工具。克隆人ABCA1基因的启动子; 构建ABCA1 启动子的报告基因载体并进行活性分析。设计合成ABCA1启动子引物，采用PCR 技术从人基因组DNA 中扩增ABCA1启动子; 将扩增片段插入载体并利用酶切与测序进行鉴定; 亚克隆该基因至pGL3-Basic 荧光报告基因载体; 瞬时转染细胞，用双荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性。 1.2 ABCA1 基因结构及其功能 ABCA1是在1994年由克隆获得，可在人体50多种组织特别是含有炎症细胞和淋巴细胞组织中广泛表达。ABCA1蛋白是由2261个 氨基酸连续构成的阔膜蛋白，其分子量为254kDa。ABCA1有两个跨膜结构域(transmembramne domain , TMD)，两个核苷酸结构域(NBD1和NBD2)，核苷酸结合位点与ATP结合为跨膜转运提供能量，此区域包括高度不保守的肽序列WalkerA 和Walker B，一级ABC运转子独有的标记Walker C[1]ABCA1基因位于9q31，共149kb，包括启动子区1453bp，外显子50个，内含子49个，两者共146581bp，转录起始位点，位于氨基酸密码子上游315bp，开放阅读框架，编码的蛋白质为ABCA1,。ABCA1基因表达受多种基因调节，主要集中在转录水平和转录后水平[2]。ABCA1参与许多生理功能，人类的很多疾病与之有关。ABCA1主要参与功能为胆固醇逆转运。 1.3国内外研究现状和发展趋势 ABCA1相关的疾病研究 三磷酸腺苷结合盒运转体A1的研究(ATP binding cassette transporter A1. ABCA1)对于脑的意义在于三磷酸腺苷结合盒运转体A1在脑组织中广泛的表达[3],它将脑细胞中的胆固醇转运给载脂蛋白E(apolipoprotein E, apoE)及载脂蛋白A1(apolipoprotein A1,apoA-1)形成高密度脂蛋白(high dendity lipopeorein, HDL)，从而调控胆固醇平衡。研究表明ABCA1与胆固醇代谢的脑疾病有着密切的关系包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)、创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)及脑梗死。在脑组织中，ApoE是ABCA1的主要载脂蛋白接受体，形成新生HDL进入脑脊液(cerebro-spinalfluid,CSF).研究表明，在神经细胞，ABCA1 除了转运胆固醇和磷脂，还转运24(S)-羟胆固醇[4]。ABCA1可以通过防止脂质过多聚积二保护脑。ABCA1活性丧失导致脑组织中APOE蛋白水平下降，并且贫脂的载脂蛋白也快速的分解。鼠ABCA1 缺乏会减少脑组织APOE及APOA-1蛋白的水平，但是对APOA-1的影响弱于ApoE的影响[5] ABCA1启动子区基因多态性与血脂水平级冠心病有关，ABCA1基因启动子-14bp单核苷酸多态性(SNP)位点与冠心病发生及血脂水平关系可以用PCR法检测ABCA1基因-14bp位点SNP并进行分析，酶法测定血总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)，直接已补发测定血脂水平。ABCA1是重要的胆固醇逆向转运的其实环节，ABCA1正常表达可提高循环高密度脂蛋白水平，因此ABCA1对为此细胞内外的胆固醇平衡、调节血脂以及防止动脉粥样硬化的发生可能有重要意义[6] 冠心病人群中一半的人伴有HDL血症，HDL-C与CHD呈高度负相关[15]并且在低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和甘油三酯(TG)升高时HDL与冠心病负相关更明显。研究表明低水平的HDL在动脉硬化的发生于发展中有着重要意义[16]ABCA1基因突变导致罕见遗传性疾病Tangier病(Tangier disease ,TD)[17]和家族性低α脂蛋白血症(FHA)[18]现有的研究发现，即是普通人群ABCA1基因变异引起ABCA1蛋白功能障碍也影响血浆中HDL水平[19]. ABCA1在胆固醇