DNA粗提取与鉴定实验概述.pptx

DNA粗提取与鉴定实验; 内容;一、课题分析;2.背景描述 生物体的性状之所以能够遗传给后代，是由于其体内具有DNA或RNA这些遗传物质，DNA是遗传物质已经通过实验证实。 那么DNA究竟什么样？ 本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的理化性质，理解DNA提取以及鉴定的原理，在一定层面感性认知DNA。 ;;核苷酸结构;一、课题分析;一、课题分析;一、课题分析;一、课题分析;洋葱内表皮细胞DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色;二、教学建议;三、材料器具;DNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度。DNA对紫外线有吸收作用，当核酸变性时，吸光值升高； 当变性核酸可复性时，吸光值又会恢复到原来水平。温度、有机溶剂、酸碱度、尿素、酰胺等试剂都可以引起DNA分子变性，即使得DNA双键间的氢键断裂，双螺旋结构解开。 ;1、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响； 大多数蛋白质不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性； 洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响。 ;2、DNA的溶解度 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反。 ;1、实验材料的选取 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，更具有操作性，根据实验目的选取适当的材料和方法。 鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。 ;2、细胞破碎 动物细胞：没有细胞壁破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。 原理：蒸馏水对于细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。 植物细胞：需要先用一定的洗涤剂和氯化钠溶解细胞膜，洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放，氯化钠有利于DNA的溶解。 研磨：使DNA充分释放，洗涤剂等更容易充分接触细胞膜。用液氮研磨可有效的防止DNA降解。 ;2、细胞破碎 DNA降解的原因： 温度：高温,易加速磷酸二酯键的水解。 湿度：参与磷酸二酯键的水解 、影响DNA螺旋的形成结构。 pH值：氢离子参与与催化磷酸二酯键的水解 、过高或过低的pH值都易破坏氢键 。 氧化反应：氧化碱基中的含氮杂环,使其变性,从而进一步改变一级与二级的DNA构象。 DNA降解酶：水解DNA。 ;3、DNA的纯化 细胞破碎后主要含有蛋白、多糖和RNA等杂质。可根据DNA的性质进行纯化。首先可通过过滤、离心等方法去除不溶解的杂质，然后再进一步纯化。 氯化钠中的溶解度，氯化钠浓度为2mol/l时DNA溶解度最大，可在此浓度下先溶解DNA，然后过滤去除不溶解的杂质，然后在DNA溶解度最低的氯化钠溶液中（0.14mol/l）使DNA析出，再过滤去除溶解在氯化钠溶液中的杂质。 ;3、DNA的纯化 利用蛋白酶降解蛋白质，加入嫩肉粉（木瓜蛋白酶）、蛋白酶K等，降解蛋白质。 适当温度降解蛋白质，65-70℃，DNA不会被变性，蛋白会变性。 不溶于水的有机溶剂，酚、氯仿等，DNA不溶于这类试剂，蛋白质可溶解在其中，通过静止或离心使有机试剂和水分离，去除杂质。 DNA结合柱，硝酸纤维素膜等，在酸性条件下可结合DNA，中性和碱性条件下结合能力差。通过DNA的等电点调节其所带电荷为正电或负电，通过孔径去除大分子和小分子。 ;4、DNA的析出 溶于水的有机溶剂可使DNA析出，水更容易和有机试剂结合，使DNA析出，如一定浓度乙醇、异丙醇（乙醇浓度一般在48-67.5%，异丙醇浓度在36%以上，浓度越高效果越好），低温效果更好（杂质较多），同时，可在一定程度上出去溶于该有机试剂的杂质。 5、DNA的溶解 一般采用TE（Tris-EDTA，pH8.0）缓冲液或去离子水。 ;6、 DNA的鉴定 DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色； 可被甲基绿染成绿色； DNA对紫外线（260nm）有吸收作用； DNA可与溴化乙锭（EB）花青素类染料结合，可在紫外光下激发荧光。 ;1.植物材料的研磨：称取新鲜植物材料（菠菜）100g，表面清洗后，在研钵中充分研磨，可加入石英砂，将植物组织充分研磨（可加入适量的提取缓冲液）。 2.将研磨好的样品取出置于200ml烧杯中，加入100ml 10%的SDS轻轻混匀，65℃水浴10-15min后取出。 3.用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上。 4.用20mL 2mol/L的NaCl溶液，溶解粘稠物，在20