mofloXDP流式细胞仪基本原理以及应用概述.pptx

流式细胞仪基本原理以及应用;细胞研究必备的仪器;;;流式细胞仪是细胞组学的定量工具;流式细胞仪的检测范围;流式细胞仪基本原理;成功的流式实验需要三步走：;流式样本制备;单细胞悬液制备;培养细胞 一般处理：消化分散成单细胞，过300目滤网去除细胞团块 易聚集的细胞：可在缓冲液中加1~3%的小牛血清或BSA或0.05%EDTA ;组织细胞 脾细胞，在缓冲液中将血洗净，剪成数块，直接在300目滤网上研碎过筛 肝、肾组织及结肠癌等富含实质细胞的组织，于缓冲液中充分剪碎，细胞分散于缓冲液中，过100目滤网，再过300目滤网 肺、肠粘膜等结缔组织较多的组织，剪碎并用胰酶、胶原酶等消化分散 骨、软骨、心肌、骨骼肌、脑组织等，可尝试机械剪碎及酶消化后于培养液中静置贴壁分离细胞，但可用的细胞往往较少，最好进行原代培养 ;外周血样本：在??处理的情况下于4度存放3~5天，仍可用于大多数 表面分子标记检测。但做细胞绝对计数应在24h内检测 固定：低浓度的甲醛或多聚甲醛固定（1%）可用于培养细胞或已 分散成单细胞的组织来源样本的短期保存（1周） 过高浓度的甲醛会影响抗原抗体结合及导致荧光淬灭，不适合流式检测 长期保存：可参考细胞和组织的冻存（深低温或液氮） DNA倍体检测：可用-20度预冷乙醇固定（终浓度80%），固定时 震荡逐滴加入，避免结块，1~2ml/样本，存放于-20度（1月） 注意：已标记荧光的样本和对细胞活力有要求的样本应尽快检测， 以免荧光淬灭及细胞活力丧失;荧光标记;荧光素的选择;荧光素的选择;荧光检测通道之间的干扰;;荧光素的选择原则;;荧光补偿的调节软件的手动、自动补偿和离线补偿;自动补偿;检测的一般步骤;流式细胞仪基本结构;液流系统 Fluidics;光路系统;MoFlo XDP光路精致设计，开放性强;;前向散射角（FS）;侧向散射角（SS）;电路系统;如何看图;分选系统;分选原理（电荷式分选）;MoFlo? XDP：喷嘴种类多，适合不同研究对象的需要;Enrich mode;液滴模式(Envolope)如下原则;;独家的混合分选模式：四路分选分别选择不同的模式既有高纯度细胞，又不浪费任何一个细胞; 如何设门;软件去除粘细胞;适合所有应用的细胞接收系统分选角度定位 ; Summit Software Windows XP 系统 SUMMIT软件涵盖所有的数据和图形处理功能 SUMMIT软件以数据库储存为基础，支持自动补偿，离线补偿，多文件分析报告等最先进流式软件性能 SUMMIT软件完全开放安装，可以分析所有国际标准LMD/FCS数据，方便使用 SUMMIT软件界面简单，易学易用 SUMMIT软件独有单参数图颜色示踪功能 ;软件对分选效果的影响;流式细胞仪的应用;;0.0017%;淋巴细胞亚群的分析和分选;活化T淋巴细胞;注意事项;2.CD45/SS设门 ;分选 CD44 FITC/CD133 PE细胞(肿瘤干细胞）;分选后的细胞皮下注射研究干细胞致瘤性;细胞周期分析 / DNA含量分析;推荐设门：;细胞凋亡;ANNEXIN V/PI凋亡分析;样本制备： 1、未染细胞 2、单染细胞（建立凋亡模型，必须有凋亡群体存在，用于补偿调节） 3、实验样本;注意事项： 1.PI毒性，一小时内测完 2.贴壁细胞消化和吹打时混匀，注意离心力和离心时间 3.不能固定，要在冰上操作 4.假阴性：并非所有凋亡细胞都会出现PS外翻 5.假阳性：坏死细胞含少量PS；补体激活细胞可能发生PS外翻；血小板存在PS外翻；巨噬细胞或其他细胞吞饮凋亡小体时，Annexin V检测也会阳性 ;细胞增殖的检测与分析-CFSE标记;胞内活性氧水平的检测与分析-DCFH-DA 单染;THANK YOU