2015年分子生物学--2基因重组和转座--2概述.pptx

分子生物学 Molecular Biology 生命科学与农学学院 王雪芹 Email: wangxueqin0218@163.com Tel:第六章 DNA的重组与转座 DNA recombination and Transposition;发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称普遍性重组、基本重组，是最基本的DNA重组方式。通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 ;;;一、同源重组的分子机制 1.同源重组的基本条件 在交换区具有相同或相似序列 双链DNA分子间互补配对 重组酶 同源重组需要一些蛋白质因子（如大肠杆菌的Rec A、B、C、D）及酶（如DNA连接酶）等。 异源双链区的形成 ;2.同源重组的分子模型——Holliday模型 此模型中，同源重组主要有4个关键步骤 ：;Holliday中间体;;二、同源重组的酶学机制; RecA蛋白介导的DNA链交换模型 A:DNA链交换的侧面观: 1.RecA蛋白与单链DNA结合；2.复合物与同源双链DNA结合；3.入侵单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来; B:DNA链交换过程RecA蛋白的横切面;2. RecBCD酶：产生参与重组的DNA单链 该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码。 Rec BCD酶具有三种酶活性： ① 依赖于ATP的核酸外切酶活性， ② 可被ATP增强的核酸内切酶活性， ③ ATP依赖的解螺旋酶活性。;　 当DNA分子断裂时，它即结合在其游离端，使DNA双链解旋并降解，解旋所需能量由ATP水解供给。及至酶移动到chi位点(5′GCTGGTGG3′)，在其3′侧4～6个核苷酸处将链切开，产生具有3′末端的游离单链。随后单链可参与重组各步骤。大肠杆菌基因组共有1009个chi位点，分布在DNA各部位，平均5kb有一个，成为重组热点。;3. RuvABC:产生促进异源双链的形成和切开Holliday联结体。 RuvA蛋白能够识别Holliday联结体的交叉点，RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象，使分支点易于移动。 RuvA帮助RuvB六聚体环结合在双链DNA上。 RuvC是一种核酸内切酶，特异识别Holliday联结体并将其切开。 ; Ruv AB复合物结合于Holliday联结体的模型 ;转化 transformation 接合 conjugation 转导 transduction 细胞融合 cell fusion ;1.细菌转化;　 有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低，但在实验室中可以人工促使转化。例如大肠杆菌，用高浓度Ca2+处理，可诱导细胞成为感受态，重组质粒得以高效转化。 人工转化的机制目前还不十分清楚，可能与增加细胞通透性有关。;　;2.细菌接合;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;　;3.细菌转导 　 转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。 普遍性转导:是指宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌； 局限性转导:某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合部位的DNA切割下来取代病毒DNA。;　 在上述两种类型中，转导噬菌体均为缺陷型，因为都有噬菌体基因被宿主基因所取代。缺陷型噬菌体仍然将颗粒内DNA导入受体菌，前宿主的基因进入受体菌后即可与染色体DNA发生重组。 ;4.细菌的细胞融合 　 在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜整合导致的基因转移和重组。在实验室中，可用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使之成为原生质体，可人工促进原生质体的融合，使两菌株的DNA发生广泛的重组。; 第二节 位点特异性重组;1. 重组结果 ①整合;1. 重组结果 ②缺失;1. 重组结果 ③倒位; λDNA通过重组整合到大肠杆菌染色体的专一性位点上，转变成为原噬菌体DNA的非活性状态。 一般位点专一性重组都具有λ整合作用的两个基本特征：①交换是相互的和保存原先的DNA，是典型的保守性重组（conservative recombination）；②它发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列中的专一性核苷酸上。;2. λ噬菌体的整合与切除 λ噬菌体侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长还是溶源生长两种生活型的选择，其DNA在不同生活型之间的转换包括两种状态：进入溶源状态需要λDNA整