120第十九章蛋白质变性与复性概述.ppt

基因工程下游技术简介之蛋白质变性与复性 蛋白质复性举例 造血干细胞因子的复性 蛋白浓度对SCF复性的影响 GSH:GSSG对SCF复性的影响 pH对SCF复性的影响 氧化剂对SCF复性的影响 还原剂对SCF复性的影响 粘稠剂对SCF复性的影响 缓冲液浓度对SCF复性的影响 复性时间和温度对SCF活性的影响 离子浓度对SCF复性的影响 * N 端 C端 细胞色素b 乳酸脱氢酶 免疫球蛋白 环境的变化或是化学处理都会引起蛋白质天然构象的破坏，并伴随着生物活性的丧失，这一过程称之蛋白质变性。 4.9 变性剂可引起蛋白质去折叠 变性剂 天然蛋白 天然蛋白 天然蛋白 去污剂 尿素 变性蛋白 变性蛋白 尿素 盐酸胍 核糖核酸酶A变性，酶的三级结构和活性完全丧失，生成含有8个巯基的多肽链。 加脲和巯基乙醇 去除脲和巯基乙醇，又恢复到天然状态 核糖核酸酶A变性和复性 Anfinsen等人用含有2-巯基乙醇的8M脲的变性剂使核糖核酸酶A（Rnase A）变性，导致酶的三级结构和催化活性完全丧失，生成含有8个巯基的多肽链。 如果使变性的酶氧化和再折叠，8对巯基可以随机配对的话，那么就有可能生成105种不同二硫键的结构，但具有生物活性的只有一种。事实上当除去还原剂后，在8M脲的环境下氧化，形成的蛋白质中有99％都含有不正确的二硫键，而且活性大约是原来酶活性的1％。 如果将还原剂和脲同时除去，并且稀释还原的蛋白并将它于生理pH条件下暴露在空气中，Rnase A会自发地获得它的天然构象，恢复正确的二硫键和充分的酶活性。实验表明正确的二硫键只有当蛋白质折叠成它的天然构象后才能形成。 一种名叫Prion（朊病毒 ）的蛋白质（28KD）已经被证实是疯牛病以及其它相关疾病，如羊的搔痒症以及人类的海绵状脑病的致病介质。 Prions是在神经组织的细胞膜上发现的一种糖蛋白。当prion蛋白的正常构形（图a）变性折叠成非正常的构形（图b）时，疾病就发生了。 疯牛病是由于蛋白变性引起的 正常的Prion蛋白含有大量的α螺旋 病变的Prion蛋白含有更多的β折叠 羊搔痒症大家都知道，但还从未发现跨物种的传播。但疯牛病就是爆发了，而起因可能是饲料里的羊肉粉末。如果吃了疯牛病发作的牛的肉，则可能引发人类的海绵状脑病。正常的Prion蛋白含有大量的α螺旋，而病变的蛋白却含有更多的β折叠。这些β折叠在蛋白质间相互作用，形成不溶的凝块。摄入的异常prion蛋白利用免疫系统的巨噬细胞在体内运输并最终到达神经组织，然后一直传到脑部。 影响SCF复性的主要因素 因素 实验范围 pH 3-12，间隔0.5pH单位 蛋白浓度 50-300ug 间隔50ug 氧化剂 硫酸铜 0-120umol/L 间隔20umol/L 还原剂 DTT, 二巯基乙醇 GSH:GSSG 10：1—1：10 单位mmol/L 粘稠剂 脲，聚乙二醇，环糊精，甘油 缓冲液 TrisHCl, 磷酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐 表面活性剂 NP-40, 吐温， Triton-100 离子强度 0.01-1mol/L 温度 4---25 其他 精氨酸，甘氨酸, 5 8 10 10 10 10 比活 x10000 300 250 200 150 100 50 蛋白浓度 ug/ml 5 7 7 5 8 10 10 10 10 效价 x1000 1:5 1:2 0.5:1 0.1:1 1:1 2:1 1:0.5 1:0.1 5:1 GSH/ GSSG mmol/L 100 1000 1000 5000 10000 10万 10000 5000 1000 100 100 1