核酸分子杂交(研究生课程)资料.ppt

内容提要 随机引物标记 DNA缺口平移标记 全程RNA探针标记 化学法全程标记 3′末端标记 5′末端标记 一、设计原理 一、设计原理 一、设计原理 （一）液相杂交 （二）固相杂交 （三）原位杂交 （四）基因芯片技术 1.菌落杂交 4.点杂交和狭缝杂交 1.何谓分子杂交?其原理是什么？杂交的影响因素有哪些？ 2.常见的分子杂交的种类有哪些，其应用什么? 3.何谓探针，标记方法有哪些？ Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA DNA样品点到滤膜上 1 变性 2 中和 3 固定DNA 4 与标记探针杂交 5 洗脱与显影 探针DNA 探针标记 变性 将探针加到固定的DNA上 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量 1）定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交。 5. 原位杂交 保持组织细胞的形态 对核酸无抽提，修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定 2）杂交过程 （1）组织或细胞的固定，理想固定液应具备： （2）组织细胞杂交前的预处理 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落 （3）探针的选择与标记 以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为50～300bp ,有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定检测结果分辨率高，但信号检测时间长 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易于观察 （4）杂交 杂交液体积小：10～20μl cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ 杂交时间:DNA探针杂交为2～4h.RNA探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变性 冲洗温度一般不超过50 ℃ 化学法全程标记(生物素或地高辛标记) 与地高辛标记的探针杂交 加入与碱性磷酸酶结合的 抗地高辛抗体 加入 底物 BCIP/ NBT CSPD 末端标记 3’-末端标记 5’ 3’ 3’ 5’ 5’末端突出的DNA 5’ 5’ 3’ 3’ 3’末端标记的DNA 完整双链DNA KlenowDNA聚合酶 32p—dNTP 变性 32p末端标记的 单链DNA探针 末端标记 5’-末端标记 乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质 凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50 微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针。 五、探针的纯化 第三节 杂交类别与应用 三种印迹技术的比较 点杂交/狭缝杂交 菌落杂交 Northern 杂交 Southern杂交 反点向杂交 一、MASA液态芯片 二、杂交的基本分类 MASA是一种在悬浮液态体系中进行的生物分子间反应，并以100种不同荧光编码的微球作为探针的一类新型生物芯片技术。它集合了流式细胞技术、数字信号处理技术、激光技术及传统化学技术为一体，是一种新型生物分子检测技术。其反应体系中可以进行大分子蛋白、小分子蛋白、核酸等生物的检测。 MASA技术的原理是用不同的荧光颜色对乳胶颗粒进行编码使之具有检测多个靶分子的能力 二、杂交的基本分类 概念：反向点杂交(reverse dot blot， RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，是将探针固定在玻璃芯片或尼龙膜上，用于检测扩增产物中是否含有目标基因的技术。 二、反点向杂交 原理与应用：RDB是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA样本(一般是经