核酸分子杂交技术分析.ppt

第二章 核酸分子杂交技术 （DNA/DNA or DNA/RNA） 核酸分子杂交技术： 具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链 探针(序列已知，单链) 主要内容 第一节 分子杂交技术的理论基础 第二节 核酸分子杂交的方法 第三节 核酸杂交的探针 核酸分子杂交技术： 1968年华盛顿卡内基学院（Carnegie Institute of Washington）的Roy Britten 及其同事发明的 第一节 分子杂交技术的理论基础 关键步骤： 变性—杂交（复性）--检测信号—结论  5、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉 膜上印迹杂交 原位杂交 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法 核酸分子杂交实验步骤： 印迹转移：将核酸样品转移到固相支持物滤膜上 主要三种方式：毛细管虹吸作用 真空抽滤作用 电场作用 杂交：将具有核酸等样品印迹的滤膜同带有放射性标记或其他标记的DNA或RNA探针杂交 2、常用的印迹转移方法（Southern blot） 1）毛细管虹吸印迹法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上 2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上 3、同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上 1、转移缓冲液中含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠 2、上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜 向上运动 3）真空转移法 原理与毛细管虹吸法相同 不同点：滤膜在下，凝胶在上的方式 将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上 Southern DNA印迹杂交 Southern DNA印迹杂交 使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。 E. Southern于1975年首先设计出来的，故又称： Southern blot Southern 印迹杂交的主要流程 1）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 2）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记 3）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性为较短的单链 DNA, 然后置于 中性缓冲液 或者 凝胶缓冲液 之中 4）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程 理想的固相支持物应具备的特性 ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 非特异吸附少 常用的固相支持物(滤膜) 尼龙滤膜 硝酸纤维素滤膜 叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM） 二乙氨乙基纤维素滤膜（DEAE） 特点：进行核酸杂交时，滤膜容易 操作和保存 （与凝胶相比） 滤膜的选择 核酸的特殊性、分子大小 杂交过程中所涉及的步骤的多寡及敏感性等参数 硝酸纤维素滤膜：不能滞留小于150bp的DNA片段 不能同RNA结合 广泛变性后的RNA很容易转移到硝酸纤维素滤膜 （P.S.Thomas, 1983） 改变缓冲液可以改善硝酸纤维素滤膜对小片段DNA的滞留能力 (G.E.Smith,1980 :1mmol/L CH3COONH4和0.2mmol/L NaOH缓冲液代替SSC) 尼龙滤膜 较为理想的固相支持物 结合核酸能力强 转膜后可多次重复使用（每次杂交的探针可以洗去而结合的DNA酶切片段不容易被洗去） 缺点： 杂交信号的本底较高 5）Southern杂交 1、预杂交