核酸序列分析分析.ppt

C G TT CC A CC T 每次向反应体系中加入一种dNTP 相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况 峰高与掺入的核苷酸数量成正比 多余的dNTP在加入下一种dNTP前就被降解 Genotypes are clearly distinguished 纯合子 杂合子 ACTGCCT GCTGCCT A/GCTGCCT Tri- and tetra-allelic SNPs C/C T/T G/G C/T C/G T/G Genotyping of tri-allelic SNP (C/T/G) Advantage of Pyeosequencing Fast Accuracy Flexibility Multiplexing Simple Sequence Efficient Short Optimization Time Pyrosequencing焦磷酸测序系统的卓越表现： 99.998% accurate (based on analysis of 100,000 wells with known genotype) 谢谢！ * N4-06 目前都用 Sanger 的生合成法，以目標核酸為模板，加入四種核酸及 polymerase，複製該段核酸；但除了所加的四種核酸外，額外加入其中一種核酸的抑制劑衍生物 (dideoxynucleotide)，則合成反應將可能止於這種核酸的位置上，因而可得到各種長短不同的片段，以電泳可以依序排列出來。 * N4-04 核酸 定序方法的精髓，在於如何製得一系列的核酸片段，而這些片段各中止於不同的鹼基。 講義圖 3 說明這些定序方法的原理，有兩種方法可以製備一系列長度的核酸片段。 1mL=1000μL 1μL=1000nL 1nL=1000pL 1pL=1000fL 1mL=1000μL 1μL=1000nL 1nL=1000pL 1pL=1000fL 1mL=1000μL 1μL=1000nL 1nL=1000pL 1pL=1000fL * Detecting the light The enzyme cascade system generates a flash of light that is detected by a CCD camera and visualized as a peak in a pyrogram. 尹铁球ytqstar@163.com 核酸序列分析 Sangers Method Sanger (剑桥大学教授) 1955年确定牛胰岛素结构 1958年获诺贝尔化学奖 1977年设计出DNA测序法 1980年获诺贝尔化学奖 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段 Sanger法第一步：加入复制终止剂 荧光检测探头 电泳，看谁跑得快 dNTP和ddNTP的分子结构式 ddNTPs are chain-terminating nucleotides: the synthesis of a DNA strand stops when a ddNTP is added to the 3’ end 2′, 3′双脱氧核糖核苷三磷酸 The absence of 3’-hydroxyl lead to the inefficiency of the nucleophilic attack on the next incoming substrate molecule. Phosphodiester bond P R P R P R P R P R P R OH 5 3 1 3 5 1 2 3 4 5 6 PO4 2- H 3 5 2 H dideoxynuceotide 中止 ddNTP 生合成核酸定序法的反应 可正常连接 无法再接下去 If one ddGTP is added to 100 dGTP, DNA synthesis aborts at a frequency of 1/100 every time the polymerase meets a ddGTP Tell from the gel the position of each G Sanger法第二步：荧光检测 核酸测序原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ATC 32P AT 32P A 32P T A G C T A G C ATCG 32P ATCGA 32P ATC