植物类生长激素—赤霉素的发酵生产及分离纯化与各参数的测定实验资料.docx

植物类生长激素—赤霉素的发酵生产及分离纯化与各参数的测定实验 一、赤霉素的分批发酵 实验目的： 1、学会发酵罐过程操作 2、掌握发酵液中氨基酸、还原糖、总糖和赤霉素含量测定方法。 实验原理： 赤霉素工艺流程图： 菌种制备→→→一级培养→→→二级培养→→→发酵培养 发酵液预处理→→→过滤→→→浓缩→→→萃取→→→脱脂 重结晶→→→产品 实验步骤： 1、培养基的配制与灭菌 种子培养基：察氏培养基（硝酸钠 3g 磷酸氢二钾 1g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g 氯化钾 0.5g 硫酸亚铁 0.01g 蔗糖 30g 琼脂 20g 蒸馏水 1000mL 制法 加热溶解，分装后121℃灭菌20min。） 发酵培养基：马铃薯培养基、大米斜面培养基和槐树枝斜面培养基。 2、种子活化与扩大培养 3、发酵罐的灭菌与接种 4、发酵工艺控制 二、赤霉素含量标准曲线的测定 实验目的： 熟练掌握赤霉素含量标准曲线的测定方法 实验原理： 赤霉素在加热条件下能使Fe3+还原产生Fe2+，Fe2+与邻菲罗啉形成红色络合物，然后在分光光度计下测定吸光度。 实验器材： 水浴锅、比色管、比色皿、pH=5的HAc-NaAc缓冲溶液、lNaF溶液、邻菲罗啉溶液、Fe3+溶液、分光光度计。 实验过程： 每隔一段时间取一定量的发酵液于25ml比色管中，依次准确加入3.00mlFe3+溶液和4.00ml邻菲罗啉溶液，摇匀，在沸水中加热50min后，取出，冷水冷却至室温，加入3mlNaF溶液和5ml pH=5的HAc-NaAc缓冲溶液，用水定容至刻度线，摇匀，用2ml比色皿以相应试剂空白作参比，在波长510nm处测定溶液的吸光度A。 结果处理： 以时间（T）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，绘制赤霉素含量曲线图 附：赤霉素浓度与吸光度标准曲线图 三、发酵液中还原糖含量的测定 实验目的： 3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定Tr21发酵液中还原糖含量，利用糖含量这个参数，控制发酵过程. 实验原理： 在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 实验器材： 发酵液（5天）：赤霉素发酵液（GA） 3，5-二硝基水杨酸（DNS），氢氧化钠，苯酚，亚硫酸钠，酒石酸钾钠，葡萄糖，蒸馏水 可见分光光度计，电子天平，真空干燥箱，数显恒温水浴锅，离心机，移液器，枪头，500ML容量瓶，试管，500 ml 烧杯，1000ml量筒 试剂配制 （1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。 （2）3,5—二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5—二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（ 182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中 ），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。 （3）碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。 （4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。 （5）0.1% 酚酞指示剂。 （6）6 mol/L HCl溶液 实验步骤： 1、葡萄糖溶液标准曲线： 分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于15 ml试管中，用蒸馏水补足至1.0ml, 分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15ml刻度。在540nm波长下测定吸光度。 2、样品测定： 每隔一段时间取适量发酵液液，稀释10倍，取稀释后的发酵液液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数。求出样品中糖含量 四、发酵液中总糖含量的测定（方法与还原糖的测定方法相同） 实验目的： 熟练掌握发酵液中总糖含量的测定方法。 实验原理： 在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 实验器材： 发酵液（5天）：赤霉素发酵液（GA） 3，5-二硝基水杨酸（DNS），氢氧化钠，苯