植病研究法---植物线虫病害研究技术资料.ppt

植物线虫病害研究技术 主讲人：吴彩兰 植物线虫病害研究技术 第一节 植物寄生线虫的采集 第二节 线虫的分离 第三节 线虫玻片标本的制作 第四节 线虫的培养 第五节 线虫的接种 第一节 植物寄生线虫的采集 1.线虫病的症状 植物受到线虫为害后，可以表现各种症状。有的表现为瘿瘤、叶斑、坏死或整株枯死等，通常可以在病变部位找到病原线虫。但是多数线虫病表现为变色、褪绿、黄化、矮缩和蔫萎等症状，这多半是根部受害造成的。大多数病原线虫并不在地上部，往往在根部或根际的土壤中可以找到。后一种类型的线虫病，在施肥或采取其他措施以后，植株的长势可以暂时恢复，但不久又表现出原来的受害状。这类线虫病的危害性往往容易忽视。 植物的腐烂组织中，尤其是地下部分的器官，也常常发现有线虫，这就要注意区别是腐生线虫还是寄生线虫。腐生性线虫的主要特征是在水中十分活跃，口腔内没有吻针，食道多为双胃型或小杆型，尾部很长，多为丝状。植物寄生线虫通常都有发达的口针，尾部较短、尖削或钝圆。 各属线虫的为害状不同：（1）茎线虫（Ditylenchus）主要为害植物的地下茎，如块茎、鳞茎和块根等；（2）胞囊线虫（Heterodera）多寄生在植物根部支根或须根的侧面，虫体裸露；（3）根结线虫（Meloidogyne）在新生的支根或侧根上寄生后引起根结，虫体在瘤状组织中；粒线虫(Anguina）和滑刃线虫（Aphelenchoides）主要为害植物的地上部分，虫体则常在茎杆的生长点或穗部；可以传染植物病毒病的长针线虫（Longidorus )、剑线虫（Xiphinema)和毛刺线虫（Trichodorus）等，在根部外寄生，在土中十分活跃，虫体较大，而且都有发达的口针。伞滑刃线虫（Bursapheleuchus）中的松材线虫主要为害松树枝干的木质部。 2. 标本的采集 （1）病变组织的采集 植物受线虫为害后，发生明显病变的部位，往往也是病原线虫存在的部位。例如，小麦粒线虫（Anguina tritici）在籽粒虫瘿中，水稻干尖线虫（Aphelenchoides besseyi ）在穗部籽粒颖壳的内侧，根结线虫和胞囊线虫等都在根部，茎线虫则多在地下茎部。只要采集病变的组织器官，就能得到病原线虫。 （2）病根、根际土壤和大田土样的采集 对于在根部内寄生的线虫，采取根样是很重要的；而对于在根部外营寄生生活的线虫，则土样尤为重要。由于线虫世代的交替与重叠，内寄生线虫也有一段时期生活在土壤中，外寄生线虫在某一时期则在根部取食寄生，因此取样时应把根系和根际土壤一起采集。 绝大多数线虫分布在耕作层中，所以都是在0-20cm的土层中采集土样。采集土样最好在湿润的土壤中采，过于干燥和潮湿的土壤，其中线虫的存活率低。因此，土样的采集最好是用特殊的采样器，有的是半筒状的，长20- 30cm，宽20-25mm。 （3）样本的保存 采到的标本或土样要防止干燥，写好标签后随即放在聚乙烯薄膜袋中。不要用有色的或有气味的薄膜口袋，袋口要用橡皮筋扎紧。根系或土壤样本，放在冰箱中（4℃)，可保存一定时期而不致损坏。一般都在5-10℃温度下贮存。贮藏最适宜的温度对各种线虫是不同的，在5-20℃之间，但13℃时多数线虫都是能活动的。 第二节 线虫的分离 1．植物材料中线虫的分离 （1）直接观察分离法 胞囊线虫、根结线虫等根部寄生的线虫，可在解剖镜下用挑针直接挑取虫体观察。对于一些虫体较大的线虫，如茎线虫和粒线虫等，可在解剖镜下用尖细的竹针或毛针将线虫从病组织中挑出，放在凹穴玻片上的水滴中，作进一步的观察和处理。 （2）漏斗分离法 漏斗分离（Baermann）操作简便，是目前从植物材料中分离线虫比较好的方法。将带有线虫的植物组织浸在水中，短时间内在水中检查不到线虫；必须经过较长的时间，线虫离开组织而游离到水中，才能从水中收集到线虫。漏斗分离法是使游离到水中的线虫，沉集在漏斗的底部。它的装置是将玻璃漏斗（直径为10-15cm），架在铁架上，下面接一段（10cm左右）橡皮管，橡皮管上装一个弹簧夹。 植物材料切碎后用纱布包好，放在盛满清水的漏斗中。经过4-24h，由于趋水性和本身的重量，线虫就离开植物组织，并在水中游动，最后都沉降到漏斗底部的橡皮管中。打开弹簧夹，取底部约5ml的水样，其中含有样本中大部分活动的线虫。 漏斗分离法也适用于分离土壤中的线虫。方法是在漏斗的筛网上放一层细纱布或多孔疏松的纸（如市售雪花牌卫生纸），上面加一薄层土壤样本，加水后放置过夜。这种方法适用于分离活动性较大的线虫，如茎线虫、短体线虫（Praty