流式细胞术的样品制备分析.doc

流式细胞术的样品制备 2010年04月13日 星期二 02:03 流式细胞术的实验检测对象是单细胞悬液，因此需把样品制备成细胞悬液，细胞浓度为 105 ～ 107 个／ ml 。制备成的单细胞悬液经荧光或免疫荧光标记即可上机检测。样本制备的基本原则： 1. 使各种液体和悬浮细胞样本新鲜，尽快完成样本制备和检测； 2. 针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或 EDTA 处理，以清除杂质，使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态； 3. 对新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化法，机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液； 4. 对石蜡包埋组织应先切成若干 40-50 μ m 厚的蜡片，经二甲苯脱蜡到水后，再用前述方法制备单细胞悬液； 5. 单细胞悬液的细胞数不应少于 107 个 /ml 。一、新鲜实体组织样本的制备（ 一 ） 酶处理法 此法是实体组织分散为单个细胞的主要方法。由于不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异消化作用，所以应根据所用组织类型确定使用酶的种类。此外，乙二胺四乙酸 (EDTA) 能结合组织中的二价钙离子和镁离子，而二价钙离子和镁离子有维持细胞表面完整性和维持细胞间质结构的作用，因此，几种酶和 EDTA 联合使用有助于充分消化实体组织，提高细胞产出效率。下面仅介绍组织消化的一般过程，对于每种组织消化时所用的具体步骤需参考该组织细胞培养时的消化方法。1 ． 将组织剪成 l ～ 2mm 3 左右的小块。2 ． 用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酶工作浓度一般为 0 ． 1 ％～ 0 ． 5 ％。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用 0 ． 25 ％胶原酶，胶原酶对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用剂量为 0 ． 1 ～ 0 ． 3ug ／ ml 。用大于组织量 30 ～ 50 倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在 37 条件下消化组织，需每隔一定时间摇动一次。消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶需作用 20 ～ 60 分钟，胶原酶需 4 ～ 48 小时。在消化过程中，如发现组织块已分散而失去块的形状，经摇动即可成为絮状悬液，则可取出少量液体在显微镜下观察，可见分散的单个细胞和少量的细胞团，可认为组织已消化充分。3 ． 消化完毕后，将细胞悬液通过 100 目孔径尼龙网或不锈钢网滤过，以除掉未充分消化的组织。4 ． 已过滤的细胞悬液经 800 ～ 1000rpm 低速离心 5 ～ 10 分钟后，弃上清液，加 PBS 液，轻轻吹打形成细胞悬液，细胞计数后即可使用。（ 二 ） 机械法 机械法分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用 300 目尼龙网滤除单细胞悬液；采用网搓法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以常与其他方法配合使用。1 ．剪碎法（ 1 ）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；（ 2 ）用剪刀将组织剪至匀浆状；（ 3 ）加入 10ml 生理盐水；（ 4 ）用吸管吸取组织匀浆，先以 100 目尼龙网过滤到试管中；（ 5 ）离心沉淀 1000r/min ， 4~5min ，再用生理盐水洗 3 遍，每次以低速（ 500~800r/min ）短时离心沉淀去除细胞碎片。（ 6 ）以 300 目尼龙网滤去细胞团块；（ 7 ）细胞用固定液固定或低温保存备用。2 ．网搓法（ 1 ）将 100 目、 300 目尼龙网扎在小烧杯上；（ 2 ）把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；（ 3 ）收集细胞悬液， 500~800r/min 离心沉淀 2min ；（ 4 ）固定细胞或低温保存备用。3 ．研磨法（ 1 ）先将组织剪成 1~2mm2 大小组织块；（ 2 ）放入组织研磨器中加入 1~2ml 生理盐水；（ 3 ）转动研棒，研至匀浆。（ 4 ）加入 10ml 生理盐水，冲洗研磨器；（ 5 ）收集细胞悬液，并经 300 目尼龙网过滤，离心沉淀 500~800r/min ， 1~2min ，再以生理盐水水洗 3 遍，离心沉淀；（ 6 ）固定或低温保存细胞悬液，备用。二、组织活检、内镜取材标本单细胞悬液的制备正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及内镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于材料较少、制备起来比较麻烦，但其制备方法与实体组织基本相似。1 ． 取材后立即放入盛有少许 PBS 液的青霉素小瓶中；2 ． 另取一只小烧杯，杯口用 300 目尼龙网盖住，用线