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深低温保存技术在生殖医学中的应用 青岛大学医学院附属医院 低温医学科 王沛涛 概述 生殖医学：上世纪70年代末第1例试管婴儿的诞生；现在，临床已经可以开展诸如单精子注射（ICSI）、植入前诊断（PGD）等辅助生殖技术（ART）。 与低温生物学的交叉：精子深低温保存；目前，已经扩展到更广泛的领域，如卵子（未成熟卵子及MⅡ期卵子）、卵巢组织、胚胎和睾丸组织等的保存。 两学科相互促进：① 卵子保存；② 卵巢组织保存 一、生殖细胞保存 1．卵子保存 重要意义 ① 治疗前肿瘤女病人卵子保存 ② 超促排卵周期中多余卵子的保存 ③ 供体卵子库 保存方法 ① 玻璃化 ② 程控降温冷冻 冷冻对卵子造成的危害主要表现在： (1) 纺锤体损伤与染色体及DNA畸形。 (2) 细胞骨架结构破坏。冷冻剂保护剂和冷冻过程均可。二甲基亚砜(DMSO)对细胞骨架的损伤特别明显。 (3) 皮质颗粒提前释放与透明带变硬，降低受精率。 (4) 其他方面：膜的完整性、细胞代谢、细胞对损伤的控制和修复能力。 卵子细胞模式图 减数分裂（成熟分裂）：双倍体、前期、中期、后期、末期 2．精子 低温生物学与生殖医学（包括动物生殖）最为成功学科结合就是精子的深低温保存技术建立和应用。自上世纪中期广泛开展以来，带来了巨大的经济和社会效益。同时，深低温保存技术和精子库的建立为整个生殖医学科学的发展发挥了巨大推动作用。国内外都已经建立的许多临床应用的供精精子库。 最奇迹的生育/10/0719/09/6BUP7S4200014AEE.html 据英国《世界新闻报》7月18日报道，英国德比郡伯顿市37岁男子约翰 ·罗兰德在14岁时被诊断出患有睾丸癌，1988年，15岁的他在接受化疗手术前冷冻了自己的部分精子。 2009年7月，约翰和29岁女友贝吉结婚后，他用冷冻精子和贝吉的卵子接受“试管受精”手术，令贝吉成功怀上身孕。贝吉于4个星期前生下了一名健康男婴。 精子保存主要应用于 ① 供精精子库：男性无精子症的治疗（AID）。无精子症的概念包括精液无精子、附睾无精子和睾丸无精子。目前国内开展AID治疗的适应症是睾丸无精子症！即使睾丸仅有“生精细胞”，也有理论上的自我生育能力，因此，对于此类不育症仍建议首先考虑ICSI技术！ ② 自体精子保存：“男性生殖保险”。包括肿瘤放化疗前、从事生殖风险职业、任何其他原因需要保存自体精子者。供未来自己配偶生育之需，如可进行人工受精（AIH）、IVF-ET和ICSI等。 一个精子怎样实现生育愿望（ICSI） 二、性腺组织及其细胞保存 1. 卵巢组织保存 保存目的：内分泌功能、生殖功能 结构复杂性：细胞类型、体积、血液循环、神经支配等 功能复杂性：多细胞协作完成、多器官相互作用 因此：目前为止，低温保存整个生殖器官仅在啮齿类动物模型得到了验证。 所以：保存卵巢组织。 组织与胚胎学 2. 未成熟卵泡保存 针对成熟卵细胞及卵巢组织深低温保存技术中瓶颈问题，研究人员尝试未成熟卵的深低温保存技术研究。 未成熟卵泡：细胞所处的分裂周期与成熟卵子不同，相对稳定，对各种冲击的抵抗能力较高，包括对深低温保存中冰晶形成和低温保护剂毒性的耐受能力。 技术难题：未成熟卵的体外培养成熟技术仍未有突破。 2．睾丸组织及精原细胞保存 睾丸组织保存的目的，主要是保存精原细胞。 目前，除了在小鼠已经产生出后代，其他物种中还没有获得移植生育后代成功的报道。 体外培养精原细胞产生精子是一个非常好的选择，但目前的有关细胞生物学方法的建立短期内尚无可能。 适应症： ① 准备接受放化疗的患恶性病的青春期前男孩。 特别是那些接受骨髓移植的患儿，移植前准备中对生精细胞的摧毁几乎是不可复性的，即使对化疗药物不敏感的间质细胞（Leydig cells）也通常难以幸免。青春期后的这类疾病患者通常可以采取精液深低温保存，可以解决其日后的生育问题。 ② 接受睾丸穿刺活检检查术的男性不育患者。 临床治疗中：一般要求在给病人进行睾丸穿刺活检的同时，进行睾丸组织的深低温保存工作。 冷冻保存方法：① 首先制备细胞悬液（其中含有各级生精细胞及精子），然后直接进行悬液的冷冻。② 采取适宜的方案进行组织块冷冻是另一个选择。 应用：① 移植时，最好将细胞从输精管注射入小管内，其他细胞，包括间质细胞等注射入胞间隙内。② 查找精子细胞或精子，进行ICSI. 3．性腺组织保存的前景 前景：良好！极大的社会需求； 技术：有待突破！ 实际应用：试验阶段，充分告知！ 希望：① 相关技术（如：未成熟卵体外培养技术）；② 组织移植技术（如：性腺易位移植）；③ 保存技术：玻璃化。。。 三、 受精卵与胚胎的保存 胚胎的特性：与卵子细胞在结构和功能特征上明显不同；且每个