北科大微生物实验1、细菌的形态结构观察和染色论述.ppt

* * * * * 实 验 一 细菌的形态结构观察和染色 目的要求 观察细菌菌落的特征。 掌握简单染色法和革兰氏染色法的原理及操作步骤。 在油镜下观察细菌个体的形态。 了解几种细菌的特殊染色方法，包括芽孢、荚膜及鞭毛染色。 了解环境微生物的检查。 安全事项 微生物 酒精灯 灭菌锅 玻璃器皿 超净台（紫外线） 电器（电炉、微波炉…） …… 奥林帕斯(OLYMPUS)双筒生物显微镜 镜筒 物镜转换器 载物台 载物台调节钮 粗调节器 细调节器 电源 光强调节钮 孔径光阑 视场光阑 双筒目镜 摄像头 物镜 镜座 镜臂 荧光发射装置 奥林帕斯生物显微镜的使用方法 接通电源。 打开主开关。 转动光强调节钮，使亮度适中。 把标本固定在载物台上。 用低倍物镜，旋转粗调和微调来进行对焦。 调节双目镜筒间距和视度差。 再适当调节照明度。 使焦点正确地对准标本。 调节孔径光阑。 依次用低、中、高倍镜观察。 油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，下降载物台，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，再细调至看清物象为止。 换片：另换新片，必须从第9条开始操作。 观察完毕，下降载物台，取下载物台上的载玻片，将4×的目镜对准载物台，再用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸沾取少量乙醇/水擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的乙醇/水。 用毕复原：先将电压调节旋钮复原，关闭主开关，切断电源。 显微镜保养和使用中的注意事项 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 光强要适中，太亮不仅损伤灯泡寿命，也对眼睛有一定的伤害，并且无法进行图像采集。 观察时，两眼睁开，养成能够用两眼观察的习惯，使两眼同时聚焦。 观察临时制片时，不要让玻片中的水分流到载物台上，更不能使酸、碱及其它化学药品与显微镜接触。 油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。 当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。 若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物像更加清晰。 基本原理 (一) 简单染色法原理 (二) 革兰氏染色法原理 (三) 抗酸染色原理 (四) 芽孢染色原理 (五) 荚膜染色原理 (六) 鞭毛染色原理 染色剂和染色原理 微生物染色常用染料如下表： 实验内容（简单染色的方法和步骤） 涂片 自然干燥 微火固定 染色l min 冲洗 吸干 镜检 实验内容（革兰氏染色的方法和步骤） 涂片，干燥、固定 草酸铵结晶紫染液染色lmin，用水冲洗 用革氏碘液媒染lmin，用水冲去碘液 用95％乙醇脱色10-30s，至乙醇液不呈现紫色 蕃红染液复染lmin，用水冲洗 吸干并镜检 一、基本原理　　革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram 创立的。革兰氏染色法（Gram?stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细 菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反 应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色 的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的 细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时， 由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留 在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含 量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增 加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的 颜色，因此呈现红色。　　革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic?dye）初染液；媒染剂 （mordant）；脱色剂（decolorising?agent）和复染液（counterstain）。碱性染 料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色 的初染液一般是结晶紫（crystal?violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的 亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine ）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反 应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染 液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上 不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分 成G+和G-