测定糖化酶活性的方法论述.ppt

糖化酶又称葡萄糖淀粉酶,糖化酶是一种习惯上的名称，学名为α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucan glucohydrolace)。多应用于酒精、淀粉糖、味精、抗菌素、柠檬酸、啤酒等工业以及白酒、黄酒。糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。糖化酶是食品工业中常用的一种酶。 糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个个葡萄糖单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。 酶活测定方法 测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱农法（ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）、3,5-二硝基水杨酸(DNS) 等方法。 我们采用次碘酸钠法来测定糖化酶的活性。 糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下（pH范围是4～6, 温度范围是40～60℃）进行反应，生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。 次碘酸钠法： 碘与NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性条件下，未与C6H12O6 作用的NaIO可转变成I2 析出,因此只要用Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ，便可计算出未参与反应的NaIO ，由此推导出糖化酶催化所产生的C6H12O6 的含量。 具体步骤 1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2.C6H12O6 与NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI 3. C6H12O6反应完后,剩余的NaIO在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 4.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O 5.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI 注：在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与1mol NaIO作用，而1molI2产生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。只要得出对照组和实验组所消耗的硫代硫酸钠体积，两者相减就可以得出与葡萄糖反应的那部分次碘酸钠的量，从而可以确定酶解生成的葡萄糖的量，从而计算出酶活。 对照组 实验组 I2 NaIO NaIO另一部分 歧化反应 生成NaIO3 NaIO一部分与 葡萄糖反应 I2 I2 NaIO NaIO3 I2 完全歧化反应， 无葡萄糖 试剂与器材 1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、pH计、电子天平； 3.试剂 2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5%淀粉指示剂。 操作步骤 1. 取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃水浴中预热10min。 2. 加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）于40 ℃，反应10min；反应结束时，立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试管的塞子打开）。 3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，缓慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml (注意:加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) ，摇匀后在暗处放置15min后加入2mol/L硫酸2ml； 4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可），用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品（A）、空白对照（B）； 计算(1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位： 酶活力单位（U/ml）=（B－A）×（N/2）× 180.1×（