第三章生物的预处理和液固分离方案.ppt

破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物得到最大程度的释放 目的 影响细胞破碎的因素： 1 细胞壁的结构 2 破碎方法 第二节 细胞破碎 一 细胞壁的结构 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层（约20－80nm）组成 革兰氏阴性菌肽聚糖层较薄，仅2－3nm，在肽聚糖层外还有两层外壁层。外壁层约8－10nm 可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，较难破碎！ 霉菌的细胞壁较厚，约100－250nm 酵母的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎 机械法 匀浆法 珠磨法 超声波 化学法 化学试剂处理 酶解法 制成丙酮粉 物理法 干燥 冻融 渗透压冲击 二 破碎方法 机械法 高压匀浆法：适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉 等。不适用于高度分枝的微生物 高速珠磨法：利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨 作用，使细胞破碎 超声波破碎法：实验室常用影响因素：频率、液体温度 和粘度、 处理时间等 French Press 压榨压榨是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器费用较高 超声波振荡器 `^ 非机械法 化学法：采用化学试剂处理细胞，溶解细胞或抽提细胞组分 酶解法：利用酶（溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶 等）反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的 需与其它方法配合使用（辐射、渗透压冲击、反复冻融法等） 途径：在细胞悬液中加酶或采用自溶作用; 自溶作用：利用微生物自身产生的酶来溶菌，而不需外加其它 的酶 自溶的方法：加热法、干燥法 渗透压冲击法：先把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内 水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介 质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压 发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快 速膨胀而破裂 冻融法：将细胞放在低温（-15℃），然后在室温中融化，反复多次， 细胞壁破裂 干燥法：经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体 会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内 物质就会被抽提出来 方法：空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥 化学法 1 用碱处理 2 用脂溶性有机溶剂 3 表面活性剂 4 制成丙酮粉 碱处理：可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分，酸碱还可以调节溶液的pH，改变细胞所处的环境，从而改变蛋白质的电荷性质，使蛋白质之间或蛋白与其他物质之间的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取 脂溶性有机溶剂：如丁醇、丙酮等，它们能溶解细胞膜上的脂类化合物，使细胞结构破坏，而将胞内产物抽提出来 表面活性剂：常能引起细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来 制成丙酮粉：组织经丙酮脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中 细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： ? ?? ?? ?? ?? ? Y(%)=[(N0-N)/N0]×100 N0－原始细胞数量 N －经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量 三 破碎率的评价 目前N0和N主要通过下面的方法获得 ： 直接计数法 在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数 间接计数法 间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等） 具体操作： 将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量