第五章_STR自动分型概述.ppt

第六章 STR自动分型 STR自动分型 特点：自动化程度高 快速、灵敏、准确、稳定 重复性好 核心：建立多基因复合扩增体系时采用3-4种荧光染料分别标记不同的STR基因座引物，同一种荧光染料标记的STR基因座扩增产物大小不重复。复合扩增产物的片段分离识别及各个等位基因命名由自动化设备完成。 荧光标记STR复合扩增 实质：采用四、五种荧光染料，其中一种用于染料与复合扩增产物混合后同步电泳的分子量内标DNA片段，余下的3或4种染料颜色标记STR基因座。 荧光染料标记在引物的5′端，扩增后使相应PCR产物的一条链均携带标记引物的荧光染料。使扩增产物在检测设备上易识别。 注意事项: 同一荧光标记的不同STR的等位基因片段范围不能重叠，前一个STR最大的等位基因与后一个STR最小的等位基因相距最少10bp。 在一个荧光复合扩增体系中，组合荧光染料的发射波长相差越大越好。 荧光标记的分析方法 荧光法：亦称荧光PCR技术（fluoresence??PCR, F-PCR），是1995年由美国PE公司首先研制成功。 在荧光染料与引物保持完整时，荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭，而在荧光染料与引物分离后，荧光报告基团才发出报告荧光，且荧光的强度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。 荧光法融汇了PCR的灵敏性、DNA的特异性和光谱技术精确定量的优点，电脑同步跟踪，数据自动化处理，直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果，不需要做PCR后处理或检测，完全闭管操作。 步骤 步骤： 1 多色荧光标记STR复合扩增。 2 扩增产物电泳前进行处理。 3 毛细管电泳分离STR片段，激光诱导的荧光检测，由设备检测并数据化存储。 4 自动数据采集并分型。荧光颜色分离，计算片段大小，确定各个等位座的基因分型。 毛细管电泳 毛细管电泳仪的基本结构包括高压直流电源，荧光激发光源，荧光检测器，自动样品盘和控制进样、电泳、检测与记录的计算机。??????适用范围：能够检测100～500bp范围，长度相差1bp的两个DNA片段。 分离DNA片段的机制 毛细管中的聚合物溶液在一定的浓度下形成筛网状结构。DNA片段在溶液中泳动时，不同片段DNA受到的阻力不同，小片段较大片段受到阻力小，易通过。变性的DNA片段电泳迁移率与片段的大小表现为线性关系。 过 程 ABI 310 的检测路径图 毛细管电泳原理 电泳上样前样品处理 变性对检验结果的影响 对近百份血液(斑)、精斑、烟头及组织等生物样品分型结果进行比较发现，使用310电泳时，样品变性与否不影响检验结果,可简化了检验方法。310上样样品组成为12ul去离子甲酰胺、0.3ul～0.5ul ROX及lul PCR扩增产物，混匀后即可上样电泳。电泳前未变性而得到与变性一样检验结果的原因可能为：第一去离子甲酰胺(中性或弱酸性)本身有变性作用；第二于7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳中60℃ 电泳时本身可使样品变性；第三上述一、二的联合作用。 甲酰胺及ROX对检验结果的影响 长久暴露于空气中的去离子甲酰胺被氧化成甲酸盐，后者在电泳进样时有两个不利作用，一是甲酸盐会与PCR产物中的DNA竞争吸附于毛细管上，减少PCR产物中DNA上样量.二是甲酸盐本身会淬灭荧光，这两个作用的结果是降低毛细管电泳检测灵敏度，使本该能检见PCR扩增产物的结果表现为阴性。PCR扩增后模板DNA量会成千上百万倍增长，有时分析结果时虽可以看到很高PCR峰，但无法分析这些结果，原因是甲酸盐竞争的结果使ROX进样量很少(甲酸盐也能降解DNA)，无法比对分析。所以，去离子甲酰胺应分装于0.5ml离心管内，冰冻保存，防止氧化，每次使用一个；电泳时ROX用量应合适，太多则浪费，太少则电泳顺序越靠后的样品，有可能无法分析结果。去离子甲酰胺较甲酰胺纯度为高，可增加毛细管电泳检测灵敏度。 DNA 分型 电泳对荧光颜色不同的DNA片断的峰进行长度检测，并对应不同的颜色。DNA片断与内标比较后确定长度。 最后与以同样方式确定的等位基因Ladder比较，得到未知样本的PCR产物片断分型。 STR等位基因分型流程 光谱分离前的现象 荧光检测器对多色荧光信号进行检测时，荧光染料间的发射波长差值越小，不同的荧光染料间存在明显的光谱交叉重叠,光谱交叉重叠形成的干扰信号就越强。当干扰信号达到和超过数据分析设定的阈值时，就被误判为一个片段峰，一个荧光标记在不同荧光在相同的位置上显示大小不同的伪峰、无法识别片段。 光谱分离 概念：每种荧光染料标记的特殊颜色的一系列片段峰单独区分出来，同时消除不同颜色间的干扰峰，