第22章免疫学检测技术的基本原理概述.ppt

对血细胞恶性变如白血病 、淋巴瘤等的诊断，长期以来多应用细胞形态学检查和免疫细胞表型分析。由于这些方法在特异性和敏感性上的限制，对于丢失了细胞表面标志，或分化较好难以和正常细胞区别。也可能由于恶性细胞数量少，混在大量正常细胞中难以查出。 一、BCR和TCR基因重排检测 利用分子生物学，获得Ig片段的特异基因克隆及TCR各链的基因克隆，分别应用Ig基因和TCR基因重排作为B细胞和T细胞的特异标记，分别诊断B细胞来源和T细胞恶性病变引起的白血病。 具体操作： 从待检的细胞中分离出总DNA。非T、非B细胞的Ig和TCR基因不发生重排，称为胚基因。而T和B细胞在分化早期即有TCR和Ig基因重排，重排后的Ig和TCR片段，转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，然后用同位素或酶标记的Ig血病细胞进行分类鉴定。若有Ig基因重排说明恶性细胞来源于B细胞，若有TCR基因发生重排，则为T细胞来源的。如果既无Ig基因重排，又无TCR基因重排的淋巴细胞则属非T、非B细胞来源的瘤细胞。 二、限制酶切片段长度多态性组织配型法 HLAⅠ类重链基因的核苷酸序列有高度同源性，由这些基因片段克隆得HLAⅠ类专用的探针。 由于HLA等位基因的多态性表现在其核苷酸序列的差异，被限制性内切酶作用部位（切点）不同，这种酶切点只有4～6个核苷酸长度，因此来源于不同HLA单倍型的DNA可被一种内切酶切成不同长度的片段。 主要包括4个步骤： ①提取细胞总DNA，用限制性内切酶消化； ②凝胶电泳； ③将凝胶中分离好的DNA片段转移至尼龙膜上； ④经变性处理后用同位素标记的探针进行分子杂交。经放射自显影，得到显影带。即可得知分子量大小不同的DNA片段。 二、免疫细胞功能的测定 T细胞功能测定 B细胞功能测定 细胞因子检测 T细胞增殖试验 迟发型超敏反应的检测 抗体含量测定 溶血空斑试验 巨噬细胞吞噬试验 细胞毒试验 吞噬功能测定 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞染色法 凋亡细胞检测法 硝基蓝四氮唑试验 生物活性检测法 免疫学检测法 T细胞功能测定 T细胞增殖试验 迟发型超敏反应的检测 T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测： 形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁； 3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。 MTT (四甲基偶氮唑盐)比色法： 外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染。 B细胞功能测定 抗体含量测定 溶血空斑试验 可通过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量。 绵羊红细胞(SRB C)免疫动物 4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞 脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中混匀 在抗体形成细胞周围出现溶解的透明区，即溶血空斑。1个空斑区代表1个浆细胞 通过记录溶血空斑的数目可知抗原特异性B细胞的数目 加入新鲜补体，倒入平皿中培养 细胞毒试验 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞染色法 靶细胞被杀伤后，向体系中加入台盼兰，可进入膜破损的细胞内，将细胞染成蓝色。活细胞拒染而不着色。 凋亡细胞检测法 琼脂糖电泳法 正常细胞基因组DNA 凋亡细胞 TUNEL法 在细胞中加入末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和生物素标记的核苷酸 TdT能在游离的DNA3’端缺口连接标记的核苷酸 加入亲和素-酶复合物，在DNA断裂处显色 流式细胞术 Annexin V PI 凋亡早期 凋亡晚期 坏死期 巨噬细胞吞噬试验 吞噬功能测定 硝基蓝四氮唑(NBT)试验 NBT在杀菌过程中产生反应性氧中间物，其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中。光镜下计数NBT阳性细胞可反映PMN的杀伤功能。 将待测mf与鸡红细胞混合温育后，鸡红细胞被mf吞噬，根据吞噬百分率确定mf吞噬能力。 吞噬百分率=吞有红细胞的mf/mf总数 细胞因子检测 生物活性检测法 免疫学检测法 夹心ELISA或ELISPOT 荧光素标记抗体染胞内细胞因子，FACS分析 细胞增殖或增殖抑制法，如细胞因子依赖性或抑制性细胞株 细胞病变抑制法，如感干扰素抑制病毒感染性细胞损伤 检测B细胞产生的抗体 检测T细胞产生的CK 酶联免疫斑点试验-ELISpot 第三节 分子生物学技术