蛋白酶液化淀粉酶活力的测定剖析.ppt

一、蛋白酶酶活概述 二、影响酶促反应速度的因素—酶促反应动力学 三、蛋白酶活力的测定 （一）酶 1、酶的定义 酶是由生物活细胞产生的有催化功能的蛋白质，只要不处于变性状态，无论在细胞内或细胞外都可发挥催化化学反应的作用。 酶及辅酶 有些酶是简单蛋白质，有些酶是结合蛋白质，一般把结合蛋白质的蛋白部分称为酶蛋白，非蛋白质部分称为辅酶。 （四）酶的活力单位 根据不同情况有几种酶活力单位： ①国际单位IU：1961年，在最适条件下每分钟转化1μmol底物所需要的酶量为一个酶活力单位。 即1IU= 1μmol/min ②国际单位Kat：1972年，指在最适条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。 即 1 Kat=1mol/s Kat和IU的换算关系：1 Kat=6×107 IU， 1 IU =16.67n Kat ③习惯单位: 在实际使用中,不同酶有各自的规定,如: 糖化酶活力单位:在规定条件下,每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为1个酶单位。 蛋白酶活力单位：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。 （五）酶的比活力 比活力（比活性）是指每单位质量样品中（酶蛋白）的酶活力单位数，即每 mg 蛋白质中所含的 U 数或每 kg 蛋白质中含的 kat 数； 有时用单位体积中的酶活力单位表示比活力。 酶的比活力即表示酶的含量（纯度），是表示酶制剂纯度的一个指标。 如在酶的提纯过程中，随着酶逐步被纯化，其比活力也在逐步增加。 （六）酶活力测定的基本原理 一般对酶的测定不是直接测定其酶蛋白浓度, 而是测定其催化化学反应的能力。这是基于 ①在最优化条件下(最适温度、最适pH、最适缓冲液等)， ②当底物足够（过量， [S][E] ） ， ③在酶促反应的初始阶段， 酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比 （即V=K［E］）。故酶活力测定的是化学反应速度， 一定条件下可代表酶活性分子浓度。 在测定酶活力时，对反应温度、pH值、底物浓度、作用时间都有统一规定，以便同类产品互相比较。 酶单位并不直接反映出酶的绝对数量，它只不过是一种相对比较的依据。 在评价纯化酶的操作方法是优劣时，要同时考虑两个概念： 纯化倍数与回收率 纯化倍数=某纯化操作后的比活力/第一步操作后的比活力 回收率=某纯化操作后的总活力/第一步操作后的总活力   （3）放射性化学法 是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量，从而计算出酶的活性. 优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体内酶活性测定，特别适用于低浓度的酶和底物的测定。 缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续跟踪，并且同位素对人体有损伤作用。此外，辐射淬灭会引起测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。 首先测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度才与底物浓度成正比。初速度的确定一般指：底物消耗量在5％以内，或产物形成量占总产物量的15％以下时的速度。 其次，底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度(即过饱和)，否则，底物浓度本身是—个限制因子，此时的反应速度是两个因素的复变函数。 第三，反应必须在酶的最适条件(如最适温度、PH和离子强度等)下进行。此外，测定酶活性所用试剂中不应含有酶的激活剂、抑制剂； 同时底物本身不要有裂解。用反应速度(v)对酶浓度( E)作图，应得一条通过原点的直线，即v为（E）的线性函数。 三、蛋白酶活力的测定 蛋白酶能水解蛋白质为氨基酸。其制剂广泛应用于发酵食品、皮革脱毛、丝绸脱胶、医药生产中。蛋白酶按其作用pH值不同分为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶等。其活力测定方法基本相同，区别仅在于作用的pH值不同。 1、原理： 蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林------酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。 2、试剂及仪器 （1） 福林—酚试剂 称取50g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。 使用时用2倍体积的水稀释。 （2） 0.4mol/L碳酸钠溶