蛋白质的分离与纯化剖析.ppt

蛋白质研究技术 主讲：王世立 研究员 shili@sdu.edu.cn 电话：2919611 山东省医药生物技术研究中心 第一节、蛋白质的分离与纯化 一个哺乳动物细胞大约含有 10,000 种蛋白质。要研究它们的结构与功能，首先要把它们分离、纯化出来 但由于蛋白质在大小、带电性、水溶性等方面的差异，没有一种方法能够分离所有的蛋白质 首先讨论蛋白质分离、纯化的常规方法和技术，然后介绍膜蛋白（membrane protein ）的分离 蛋白质分离纯化的基本原则 选择好的材料 摸清目的蛋白质的稳定性 探索有效的抽提法和浓缩法 建立一套层析的组合 以较好的方法贮存 蛋白质分离纯化的方法 粗提： ① 盐析 ③ 有机溶剂沉淀 ② 结晶 ④ 等电点沉淀 精提 ： ① 离心（centrifugation） ② 电泳（electrophoresis） ③ 层析（chromatography） ① 离心（centrifugation） 原理：悬液中的各种粒子（细胞，细胞器及分子）有不同的分子量（mass）或密度（density），因此离心时有不同的速率 不同的蛋白质分子量差别很大，但密度差别很小。 蛋白质的平均密度是 1.37 g/cm3。 除非蛋白质结合了脂或碳水化合物，蛋白质之间密度的差异不会超过 15% 离心力由转速和从转子中心到蛋白质界面的距离决定 ① 离心（centrifugation） 沉降系数（sedimentation constant）与蛋白质的密度和形状有关，也与介质的密度和粘度有关 离心可用于两个方面： 作为一种分离技术从混合物中分离一种成分 作为一种分析技术测定物质的物理性质，如分子量，密度，形状及平衡结合常数（equilibrium binding constants） Ⅰ. 差速离心（differential centrifugation） 用于从组织匀浆中把可溶性的 蛋白质与细胞的不溶性成分分开 离心后，蛋白质留在上清 （supernatant）中，其他成分形 成沉淀（pellet） 差速离心（differential centrifugation） 采用不同的速度和时间可以分离不同的细胞结构 Ⅱ. 速率区带离心（rate-zonal centrifugation） 用蔗糖、甘油或氯化铯形成密度梯度带 高速离心机（~ 40,000 r/min） 被分离的物质分布在相应的密度带内 时间应控制好： 太短，不能充分分离 太长，所有的物质都沉淀到离心管底部 不能用于精确测定分子量，因为蛋白质的形状差异也影响沉降率 一次分离许多不同类型聚合物或颗粒的最有效方法 平衡密度梯度离心（equilibrium density-gradient centrifugation）：用 于分离 DNA 和细胞器 ② 电泳（electrophoresis）  物质在电场中移动的速度由电荷– 质量比决定 用于分离小分子，如氨基酸、核苷酸 电泳（electrophoresis） Ⅰ. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS） Ⅱ. 等电聚焦 （isoelectric focusing ，IEF ） Ⅲ. 双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis） Ⅳ. 脉冲电泳（pulsed-field gel electrophoresis） Ⅰ. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE） 凝胶 凝胶由丙烯酰胺（acrylamide）单体通过交联剂亚甲双丙烯酰胺（methylenebisacrylamide）聚合而成 凝胶孔径可以通过选择不同浓度的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺进行控制 凝胶有分子筛效应 SDS SDS（sodium dodecyl sulfate） 一种阴离子洗涤剂，几乎能破坏 天然蛋白质中所有的非共价键，从 而使多亚基蛋白质解聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白 质形状对迁移率（migration rate）的影响 SDS 以 1:2 的比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大量的净负电荷，而且电荷量与蛋白质分子量（即肽链长度）成正比。所以分子量成为决定蛋白质迁移率的唯一因素 SDS