蛋白质化学中的层析技术剖析.ppt

第四章 蛋白质化学中的层析技术 层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。 1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。 第一节 层析概述 第二节 离子交换层析 第三节 亲和层析 第四节 凝胶过滤 第五节 疏水层析 第六节 分配层析 第七节 吸附层析 第一节 层析概述 一、层析的原理 层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。 二、层析的分类 按固定相基质的形式： 柱层析、纸层析和薄层层析 根据流动相的形式： 液相层析、气相层析 三、层析前蛋白质处理 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。 1、盐析法 盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。 2、等电点沉淀 在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。 3、有机溶剂沉淀 降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀； 有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀。 四、层析基本操作过程 1、柱层析的L/d比值 2、洗脱装置 改变溶剂系统 改变溶剂系统 3、结果检测 活性检测 比活没有提高 目的蛋白与杂蛋白并没有分开 比活有所提高，但总活性回收很低 目的蛋白有损失或有失活现象 测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性 结果保存 薄层层析纸层析 照相保存or 扫描仪转为图形or 积分仪变成数据 柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理 4、层析装置的仪器化 HPLC 第二节 离子交换层析 一、原理 离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的。 高分子聚合物基质、配基和平衡离子 pH值的影响 离子溶度影响 离子取代顺序 常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素） CM-纤维素（羧甲基纤维素） 优点： 3、琼脂糖离子交换剂 优点： 对pH及温度的变化均较稳定，可在pH3～10和0～70℃范围内使用 改变离子强度或pH时，床体积变化不大 流速快，分辨率高 特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离。 4、聚苯乙烯 阴离子交换剂 Amberlite IRA Dowexl eg. Dowexl×4-100 阳离子交换剂 Amberlite IRC Dowex50 5、其他 聚乙烯醇 DEAE-Toyopearl CM-Toyopearl 富羟基 高亲水性 兼性离子交换剂 基质上连有β-丙氨酸、对氨基苯磺酸、精氨酸等偶极离子 or 凝胶网孔中 包含阴、阳离子的磷脂的脂质体 三、离子交换介质的配基 提供了可交换的离子，是由带电荷的官能团组成 通过或长或短的碳氢链经醚键结合到聚合物骨架上，相应的分别得到了阳离子和阴离子交换剂 pK值 决定了相应的离子交换剂的pH工作范围 密度 在配基密度达到一个极限值之前，蛋白质的吸附容量和保