3高效液相色谱课程.ppt

3-1 概述 高效液相色谱（HPLC）是一种以液体为流动相的快速分离分析色谱技术，采用细微粒固定相、高压输液泵和高灵敏度检测器，具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点，对于那些沸点高，热稳定性差，相对分子质量大的有机化合物如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物(类固醇化合物) 、蛋白质、氨基酸、核酸等均可进行分离分析。 3-1-1 HPLC类型 液液分配色谱：流动相和固定相都是液体。 吸附色谱（液固色谱）：流动相为液体，固定相为吸附剂。 离子交换色谱：此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。 离子对色谱法：将与溶质分子电荷相反的离子加入固定相或流动相，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，控制溶质离子的保留行为。 离子色谱法：分离水溶液中混合阴离子快速、灵敏、准确的最有效分析方法 。 尺寸排阻色谱：基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。 3-1-2高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高压：HPlC供液压力和进样压力都很高（150～350X105Pa）。高压是的一个突出特点。 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。大于30000塔板/米。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。 3-1-3 HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定有机化合物（占总数的20%）；HPLC可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定有机化合物（占80%）。 流动相的选择：GC采用的流动相为几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合（供选择的机会多）。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。 3-2 基本理论和条件选择 3-2-1 H-u曲线 HPLC与GC基本概念和理论基础一致，但也有不同。速率理论 H=A+B/u+Cu 涡流扩散项：A = 2?dp 含义与GC一样。 纵向扩散项：液体的扩散系数Dm比气体小4个数量级,当流动相线速度u0.5cmS-1时可忽略. 传质阻力项：三个部分组成，固定相传质阻力项，流动的流动相阻力项及滞留的流动相阻力项。 3-2-1 H-u曲线 3-2-2 分离条件 固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm），首选化学键合相，匀浆法装柱。 流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，约1ml/min 。 柱温的选择：选室温250C左右。 3-3 HPLC分离方法 3-3-1 液液分配色谱法（LLC） 原理：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。 固定相：原则上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：?,?’-氧二丙腈（ODPN)、聚乙二醇（PEM）、角鲨烷（SQ）。通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相。 化学键合固定相：通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点 。 流动相：根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱和反相分配色谱。 3-3-1 液液分配色谱法（LLC） 正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离。 反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离。 3-3-2吸附色谱（液－固吸附色谱） LSC流动相为液体，固定相为固体吸附剂 原理：是基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而进行分离。 分离前提：K不等或k不等。 以固体吸附剂为固定相，如极性的硅胶、氧化铝、分子筛和非极性的活性炭等（较常使用硅胶）。 流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。宜于分离极性不同或含极性基团相同但数目不同的试样，也适于分离异构体，但不宜于分离同系物。 3-3-2吸附色谱 固定相：固定相粒径10μm 1、硅胶：表孔硅胶（薄壳硅胶）、全多孔硅胶、堆积硅珠 ；原理：吸附；特点：峰易拖尾；适用：分离极性化合物。 2、高分子多孔小球；原理：吸附+分配，兼小孔凝胶作用；特点：柱选择性好，峰形好，柱效低；适用：分离弱极性化合物。 3-3-3 离子交换色谱法 此法是利用离子交换原理和液相色谱