第5讲目的基因向植物细胞转化与转基因植株的筛选鉴定技巧.ppt

第五讲 目的基因向植物细胞转化与转基因植株的筛选鉴定;一、目的基因向植物细胞转化 植物基因（遗传）转化受体系统是指用于转化的外植体通过组织培养途径或非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。 植物基因转化系统是指实现外源DNA通过载体、媒体或其它物理、化学方法导入植物细胞并整合、表达过程的途径。;植物基因转化受体系统 A、植物基因转化受体系统的条件 B、植物基因转化受体系统的类型及其特性 C、转基因的方法 D、建立植物基因转化受体系统中常遇的问题;A、植物基因转化受体系统 良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件： 1、高效稳定的再生能力： 植物细胞具有全能性，但不同分化程度的细胞，其脱分化的能力不同。 鉴于目前基因转化的频率一般较低，因此，较高的再生频率是必需的，以保证有较高的转化成功率，同时，较高再生率的稳定性和重复性也是必需的。 ;2、 较高的遗传稳定性 组培研究结果表明，体细胞无性系变异是普遍存在，其与培养方法、再生途径和外植体的基因型有关。较高的遗传稳定性有利于利用基因工程途径改良品种。 ;3、具有稳定的外植体来源 基因转化的低频率性，使得转化过程中需要反复实验，使用大量的外植体。通常优先利用无菌实生苗和快速繁殖无菌试管苗。 ;4、 对选择性抗生素敏感 目前，选择筛选转化的细胞、转化的再生植株主要是利用转化子对抗生素形成抗性，而非转化子对抗生素无此特性。因此，植物对选用的抗生素必需是敏感的，同时该抗生素对受体植物有没有严重的毒性，不会很快杀死植物细胞，否则转化的细胞也难以生活。 5、转化率高 ;B、植物基因转化受体系统的类型及其特性 1.愈伤组织再生系统 外植体经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。 优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、再生植株嵌合体多 因此需要连续的再生系统;非胚性愈伤及其细胞结构;黄瓜子房组织经脱分化 形成胚性愈伤组织;活力弱的愈伤组织;2.直接分化再生系统 外植体细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定； 缺点：材料局限，转化率低。;3.原生质体再生系统 原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高，培养周期长、难度大、再生频率低。; 4.胚状体再生系统 在离体组培状况下，任何体细胞及单倍体细胞都可以诱导胚胎发生而形成形态结构和功能上类似于有性胚的体细胞胚（即胚状体）。胚状体再生受体系统是最为理想的基因转化受体系统，其有如下特点： ;① 胚性细胞繁殖量大，同步性好，接受外源DNA能力强，因此转化效率高 ； ② 胚状体多起源于单细胞，因此再生的转化植株嵌和体少； ③ 胚状体具有两极性，发育过程中可同时分化出根和芽而形成完整植株，可免除生根培养环节； ④ 转化的胚状体可用于制作人工种子； ⑤ 无性系变异小、成苗快、数量大，利于转基因植株快繁推广； ⑥ 本系统还可以用于胚胎发生机理和转化基因的表达调控 。 ;5.生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。 ;C、转基因方法 农杆菌介导转化 基因枪转化法 化学转化法 ;1. 农杆菌介导转化法 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(root-indcing?plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。 ;(1)叶盘法----操作步骤 ;农杆菌的活化，挑单菌落;挑单克隆; 液体培养;28oC培养过夜 ;离心收集细胞; 用液体MS培养基重悬细胞; 将叶盘放入菌液中侵染3-10min;取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液;