胡学才 细胞重组技术及克隆分解.pptx

第14章 细胞重组及动物克隆技术; 14.1 细胞重组技术 14.2 细胞核移植和动物克隆技术 14.3 动物克隆技术的意义与展望 ; 细胞重组(cell reconstruction)是指从活细胞中将细胞器及其组分分离出来，再在体外一定条件下将不同来源的细胞器及其组分重新组合，使之重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。;（1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种 （2）微细胞与完整细胞重组成微细胞异核体 （3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞;（1）胞质体：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞； （2）核体: 与细胞质分离的细胞核； （3）微细胞：又称微核体，由一条或几条染色体、 少量细胞质和完整质膜包裹而成； （4）胞质杂种细胞：将胞质体与另一完整细胞融合得到的细胞。 （5）杂种细胞：核体与完整细胞融合。;;;A.细胞核移植技术：所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。 ;B.动物克隆技术：是指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。 在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。 ;近年来我国核移植技术的发展; A.分子水平上的-----基因克隆 重组载体通过宿主细胞的无性繁殖使目的基因扩增，再用某探针选取、钓取目的基因。 B.细胞水平上的------细胞系的培养（制备单克隆抗体） 单克隆抗体：利用动物细胞融合技术将骨髓瘤细胞和能产生抗体的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，再去培养，筛选到杂交瘤细胞系。 C.在个体水平上------繁殖出生物个体 不通过两性细胞的结合，从一个单一的细胞繁殖出生物个体。即细胞 ------- 个体 -;基因水平的克隆; ;植物组织培养过程;植物细胞的全能性;?;Ⅱ.和供体细胞的准备：在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组； 其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。 供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。 ;Ⅲ.细胞核移植：常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质内注射是用一个外径5～8μm 的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。 ;;Ⅳ.激活：卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态;Ⅴ.重组胚的培养：经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。 ;Ⅵ.重组胚的移植：重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。 Ⅶ.核移植后代的鉴定：一般可以从形态、性别上鉴定，还可以采用分子生物学技术进行鉴定。 ;1981年，Illmensee报道了通过核移植的方法克隆小鼠，这是哺乳动物克隆的首例成功。他们将囊胚内细胞团细胞的核移入受精卵中，同时在吸管撤出时将两个原核吸出，以减少受精卵内部被破坏的机会，经培养，移核卵发育至囊胚期，再将此胚胎植入同步孕鼠的子宫内，最后产下两雌一雄三只可育的个体。 1983年，McGrath和Solter对核移植技术加以改进，他们将显微镜技术与细胞融合技术相结合。 1986年，Willadsen将绵阳8-细胞期胚胎的卵裂球移入未受精的成熟卵子中，成功克隆了一只小绵羊。 1987年，利用显微镜技术和电融合技术首次培育出了克隆牛。 1988年，在克隆兔的研究中首次应用了电击活技术。;胚胎细胞核移植培育克隆鼠的过程;在20世纪50年代利用体细胞克隆成蛙，其后科学家一直在努力期望利用体细胞克隆出哺乳动物。 ;;Dolly的产生过程;1938年，德国科学家HansSpem