第三章蛋白质的通性纯化和表征.ppt

第3章 蛋白质的分离纯化和表征 ;一.蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的pK值与游离氨基酸的不完全相同。短肽的等电点和净电荷量可以根据pK值计算，蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。 二.蛋白质分子的大小与形状 （一）根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。 ; 例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100 ? 131)/1.65=7939.4 按照Ile的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100 ? 131)/2.48=5282.3 由于X1和X2数字差异较大，提示这种酶含Leu和Ile不止1个，为了估算Leu和Ile的个数，首先计算： X1/ X2=7939.4/5282.3≈1.5 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2个Leu，3个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ? 2 =15878.8 或 5282.3×3=15846.9;（二）渗透压法测定相对分子质量 ;（三 ）沉降分析法测定相对分子质量 ;基本原理： ⒈ 离心力（centrifugal force，Fc）： 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F = m·a = m·ω2 r a — 粒子旋转的加速度， m — 沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度， r—粒子的旋转半径( cm )。 ;⒉ 相对离心力（relative centrifugal force，RCF）: 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。 X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转子每分钟的转数（revolutions per minute,简写成r/min,或rpm）。;⒊ 沉降系数（sedimentation coefficient，s）： 1924年Svedberg对沉降系数下的定义为颗粒在单位离心力场中移动的速度。 n 若ω用2πn/60表示，则 n ;⒋沉降速度（sedimentation velocity）： 对于球形颗粒 Fc=1/6?d3(ρp?ρm)ω2X Ff=3?dv 当Fc=Ff时 1/6?d3(ρp?ρm)ω2X = 3?ηdv v =(1/18η) [d2(ρp?ρm)ω2X] Fc：离心力；Ff：摩擦力：d：球形粒子直径；η：流体介质的粘度；ρP：粒子的密度；ρm：介质的密度；v：粒子移动的速度 从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加，将此式代入上项沉降系数公式中，则S也可表示为： ①当ρP＞ρm，则S＞0，粒子顺着离心方向沉降。②当ρP＝ρm，则S＝0，粒子到达某一位置后达到平衡。③当ρP＜ρm，则S＜0，粒子逆着离心方向上浮。 ;5.沉降系数与物质相对分子质量: 根据Svedberg公式，由沉降系数可以计算出物质的相对分子质量： Mr=RTS20,W/[D20,W(1-γρ)] Mr:相对分子质量； D20,W：以20℃的水为介质时颗粒的扩散系数； R:气体常数； T：绝对温度； S20,W：以20℃的水为介质时颗粒的沉降系数； γ：偏比容，等于溶质粒子密度的倒数； ρ：溶剂密度 ;6.沉降时间（sedimentation time，Ts）: 在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来的问题，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子所需的时间。根据沉降系数的定义可得 积分得 X2:离心转轴至离心管底内壁的距离；X1:离心转轴