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第三章质粒载体2
第三章 质粒载体 第一节 质粒载体概况 第二节 质粒DNA的分离与纯化 第三节 质粒载体的构建 第四节 重要的质粒载体 第五节 质粒载体的稳定性问题 第一节 质粒载体的概况 1、质粒的定义、命名 2、质粒的基本生物学特性 克隆载体:通过不同途径能将承载的外源DNA片段(基因)带入受体细胞,并在其中得以维持的DNA分子。 作为克隆载体的DNA分子必须具备的条件: 1、有1至多个克隆位点。供外源DNA片段插入克隆载体DNA分子。 2、能自我复制或整合到染色体DNA上随染色体DNA复制而同步复制。 3、有用于选择重组子的标记基因。 4、载体必须安全,不会任意转入除受体细胞外的其他生物的细胞。 一、质粒的定义、命名 定义:质粒是一类寄宿于细胞内,独立于染色体外的自我复制并稳定遗传的环状双链DNA分子。 命名:小写字母p代表质粒,两个大写字母代表发明者,后接实验编号。如pSC101 大肠杆菌质粒分子的结构示意图 二、质粒的基本特性 寄生性 质粒DNA的构型 质粒DNA分类 质粒DNA的复制 质粒的不亲和性 其他特性 (二)质粒DNA分子的三种构型 SC构型: 是指两条多核苷酸链均保持着完整的环形 结构时,称为共价闭合环形DNA(cccDNA),即超螺 旋的 SC构型。 OC构型: 两条多核苷酸链中只有一天保持完整的环 形结构,另一条出现一至数个缺口时,称开环DNA (ocDNA),即OC构型; L构型: 质粒DNA经酶切,发生双链断裂而形成线 性分子(LDNA),L构型。(见图) 不同质粒DNA分子量差异显著,最小的不足2kb,仅能编码2-3种蛋白质,大的可达几百kb。 (三)质粒的类型 1、根据质粒的性状特征分为: (1)F质粒:又叫F因子或性质粒。能够使寄主染色体上的 基因和F质粒一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。 (2)R质粒:通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌 素抗性基因。 (3)Co1质粒 :产生大肠杆菌素因子。编码有控制大肠 杆菌素合成的基因。 2、根据质粒是否具有转移功能分为: (1)结合型质粒:分子比较大,拷贝数比较少,且宿主广。如F质粒 (2)非结合型质粒:分子比较大,拷贝数比较少。如ColE1质粒 质粒DNA的迁移:由共存的结合型质粒引发的非结合型质粒的转移过程叫质粒的迁移。 3、显性质粒和隐蔽质粒:如抗性质粒(R质粒)、降解质粒、Ti质粒。 (四)质粒DAN的复制 质粒的复制受质粒和寄主细胞双重遗传系统的控制。 严紧型质粒:每个寄主细胞仅含有1-3份的拷贝,称“严紧型”复制控制的质粒。 松驰型质粒:每个寄主细胞中可高达10-60份的拷贝,称“松弛型”复制控制的质粒。 质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对,它不仅受自身的制约,还受寄主的控制。如ColE1-K30在大肠杆菌中属松弛型质粒,在奇异变形杆菌中属严紧型质粒。 质粒DNA拷贝数的控制 高拷贝质粒DNA复制的启动,是由质粒编码基因合成的功能蛋白质调节的,与寄主细胞周期开始时合成的不稳定的复制起始蛋白质无关。 低拷贝质粒的复制是受寄主细胞不稳定的蛋白质控制的,并与寄主细胞染色体同步进行。 用蛋白质合成抑止剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞,使染色体DNA复制受阻的情况下,松弛的质粒仍可继续扩增。而严紧型质粒则不行。 (五)质粒的不亲和性 质粒的不亲和性又称不相容性,是指在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒,不能在同一寄主细胞系中稳定共存的现象。 能共存于一个细胞中的不同质粒称为亲和质粒。 彼此能够共存的亲和的质粒则是属于不同的不亲和群。属于同一不亲和群的质粒的亲缘关系上比较接近。如pMB1的派生质粒(或ColE1派生质粒)。 第二节 质粒DNA的分离与纯化 氯化铯密度梯度离心法 碱变性法 微量碱变性法 影响质粒DNA产量的因素 (1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小 质粒作为基因克隆的载体分子,一个重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。因而寄主细胞的裂解作用是分离质粒DNA的关键步骤。 通常的裂解是加入溶菌酶或SDS使大肠杆菌细胞裂解。 理想的状况是,使每个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出,而又没有污染过多的染色体DNA。 1、氯化铯密度梯度离心法 优点:可获得高纯度、高质量的质粒DNA。 缺点:操作复杂; 价格昂贵(氯化铯); 设备要求高(超速离心机); 易造成环境污染和人员伤害(溴化乙锭是一 种极强的诱变剂) 原理:是根据共价闭合环状质粒DNA与线
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