《生物制药技术教学课件》基因工程2.ppt

基因工程2 第七节 目的基因的筛选和鉴定 步骤： 一、筛选出转化菌 （一）表型筛选法 利用载体上的遗传学标记如抗生素抗性基因,外源基因插入载体并转入受体细胞后，使受体细胞获得或缺失这些标记表型 。 插入失活法 插入表达法 1 插入灭活法 insertion inactivation ： 适用于具有两个或两个以上选择标记的质粒 如: pBR322的双抗生素抗性标记 可鉴别出重组体和非重组体 （二）噬菌斑形成筛选法 噬菌体组成 A 基因Nul至J的左臂区，基因产物的功能是把病毒DNA包裹至噬菌体的头部，并进一步装配成具感染能力的病毒粒子的头部和尾部。 B 中间区（包括基因J至gam）参与基因调控、溶原状态的建立和维持及遗传重组。构建λ噬菌体载体时可以去掉以插入外源基因。 C 右臂区（包括gam 至Rz）包含λ噬菌体复制和被感染细菌裂解所必需的基因。 噬菌斑形成筛选： 噬菌体包装外源DNA分子后重组分子的长度为其野生型的75％～105％时，能形成有活性的噬菌体颗粒 ，并在平板上出现清晰的噬菌斑。 （三） 遗传互补法 重组体在宿主细胞中的表达产物可弥补宿主细胞的营养代谢缺陷 如： 蓝白筛选。 pUC载体及其衍生质粒含有lacZα基因 该基因编码大肠杆菌β-半乳糖甘酶α氨基端的α互补肽段， 宿主细胞的β-半乳糖甘酶α缺陷型。 在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，含有该类载体的宿主细胞的两个互补肽段产生活性，可分解培养基上的底物—5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal），形成蓝色菌落。 当外源基因插入lacZα基因内部的多克隆位点，X-gal的培养基的重组子由于lacZα基因的插入失活而呈白色，而含有空载体的宿主细胞显蓝色，从而达到被鉴定筛选的目的。 二、对DNA重组体进行鉴定 核酸水平上的检测 蛋白质水平上的检测 （一）核酸水平上的检测 1 核酸探针杂交法： 需有针对目的片段的特异探针 1）菌落（噬菌斑）原位杂交（in site hybridization）:菌落或噬菌斑?原位转移到硝酸纤维素膜上? 裂解、碱? 80℃左右烘烤?变性DNA不可逆的结合于滤膜上?单链DNA ?杂交?滤膜干燥?放射自显影?与原平板上菌落或噬菌斑的位置对比?确定杂交阳性的菌落或噬斑 2）Southern blot: 鉴别DNA的杂交称为Southern blot。杂交的受体是DNA片断，探针可用DNA也可用RNA 步骤：提取重组DNA或基因组DNA→限制性酶切→ DNA凝胶电泳分离→ 转膜→杂交（用各种标记的DNA或RNA探针）→显色或曝光→确定与探针互补的电泳条带的位置。 3）Northern blot: 鉴别RNA的杂交称为Northern blot。杂交的受体是RNA片断，探针可用DNA也可用RNA,受体从DNA凝胶转移到NC上，与探针片段进行杂交。 提取细胞RNA → 电泳分离 → 转膜 杂交→ 检测 2 质粒大小与酶切图谱鉴定： 提取重组质粒后直接进行琼脂糖凝胶电泳或经限制性内切酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳 3 PCR技术： 利用合适的引物，从初选出来的阳性克隆中提取的质粒为模板进行PCR反应。通过对产物的电泳分析来确定目的基因是否重组入载体中。 可鉴别目的基因的插入方向 适用于检测有限长度的外源DNA 4 DNA序列测定： N-端5’AOX1 AACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAGGATCCATGCATCATCATCATCATCATATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTGCCGGTGTTGCCGGTTTAACTACAGCTCTTCAACTTCTTCGTAAAGGACATGAGGTTACAATTGTGTCCGAGTTTACGCCCGGTGATCTTAGTATCGGATATACCTCGCCTTGGGCAGGTGCCAACTGGCTCACATTTTACGATGGAGGCAAGTTAGCCGACTACGATGCCGTCTCTTATCCTATCTTGCGAGAGCTGGCTCGAAGCAGCCCCGAGGCTGGAATTCGACTCATCAACCAACGCTCCCATGTTCTCAAGCGTGATCTTCCTAAACTGGAAGGTGCCATGTCGGCCATCTGTCAACGCAACCCCTGGTTCAAAAACACAGTCGATTCTTTCGAGATTATCGAGGACAGGTCCAGGATTGTCCACGATGATGTGGCTTATCTAGTCGAATTTGCTTCCGTTTGTATCCACACCGGAGTCTACTTGAACTGGCTGATGTCCCAATGCTTATCGCT