《生物制药技术教学课件》酶工程制药.ppt

酶工程制药 复旦大学药学院生物合成教研室 生物技术的四大支柱 酶是由生物体活细胞产生的生物催化剂，绝大多数酶的化学本质是蛋白质 酶工程enzyme engineering——是酶学、微生物学与生物化工等学科有机结合而产生的新兴边缘学科，也是现代生物技术的重要组成。 特点：是一项利用酶、含酶细胞器或细胞作为生物催化剂来完成重要化学反应，并将相应底物转化成有用物质的应用型生物高新技术。 第一节:概述 酶的催化作用很早就为人们的生活所利用。 1897年，Bucher发现酶的细胞外作用现象，酶商业化生产。(1907诺贝尔化学奖） Takamine利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破。 1969年千烟一郎利用固定化酶工业化生产。 20世纪90年代，基因工程的介入。 酶工程的发展 酶工程的三个里程碑： 酶工程研究内容 酶的生产 酶的分离纯化 酶的固定化 酶生物反应器 酶与固定化酶的应用 酶的分离、提纯及大量生产 酶和细胞的固定化 酶反应器研究 酶的分子改造与化学修饰 有机相中酶反应的研究 酶的抑制剂的开发及其应用研究 模拟酶、合成酶的研究 抗体酶、核酸酶的研究 酶的定向进化技术 酶的来源和生产 早期酶的生产主要以动植物为原料 19世纪末20世纪初开始培养微生物产酶 微生物种类繁多，酶品种齐全 微生物生长周期短、繁殖快，酶产量高 生产成本低培养条件简单 微生物具较强的适应性和突变能力 目前工业上得到的酶，绝大多数来自于微生物 酶的生产方法 酶生产的工艺过程 性质 方法 溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、溶剂萃取 电荷 离子交换层析、电泳 等电点 色谱聚焦、等电聚焦 分子大小 离心分离、凝胶过滤、透析超滤 生物亲和性 亲和层析、免疫吸附层析，亲和萃取 疏水作用 疏水层析、反相色谱 第二节 酶的分离与纯化 由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 : 1．全部操作在低温0～4℃。 2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。 3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、 少量β-巯基乙醇。 4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓 度，从而求得比活力，还要计算总活力。 酶活力（enzyme activity） 酶催化某一化学反应的能力，用酶活力单位（U）表示 1个酶活力单位（1U）: 特定条件下,在1分钟内能转化 1 μmol底物的酶量或是转化底物中1μmol的有关基团的酶量 酶的比活力（specific activity） 即每毫克蛋白所具有的酶活力单位（U/mg蛋白质) 比活力提高的倍数反映了纯化方法的有效程度 对同一种酶来说，比活力愈高，表示酶愈强 一、分离纯化酶的一般程序 粗酶液的制备：材料的选择，发酵液处理，细胞破碎及酶的抽提 酶的初步分离：盐析，等电点沉淀，有机溶剂沉淀，离心分离 酶的高度纯化（酶的精制）：层析法（凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析），电泳（等电聚焦电泳） 浓缩干燥及结晶：透析，旋转蒸发，超滤，冷冻干燥 粗酶液的制备 1、细胞破碎（机械、物理、化学、酶解） 2、酶的抽提（酸碱、盐溶液、有机溶剂） 1、细胞破碎的方法1）机械破碎法 组织捣碎法：使用高速组织捣碎器，捣碎过程中温度会迅速升高，故应注意冷却 研磨法：一般使用匀浆器，可手动或马达驱动；也有用研钵与研杵进行手动研磨 高压均质机 通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞外层结构破坏，从而使细胞破碎的方法。 2）物理破碎法 超声破碎法：利用超声波（10-15KHz）产生空穴作用（cavitation），导致液体局部、瞬间的压力变化，而使细胞破裂。超声过程是个发热的过程，应保持样品低温，并注意冷却 渗透压法：将细胞在高渗溶液中平衡一段时间后，突然转入低渗溶液中，细胞壁由于渗透压的突然变化而破碎。只适合细胞壁比较脆弱的细胞 冻融法：将细胞在低温下（＜-15℃）冰冻后，再在室温下融化，反复多次。只适合胞壁易碎的细胞 3）化学法 溶剂处理法：脂溶性溶剂可溶解细胞膜上的脂质化合物，使细胞膜结构破坏 表面活性剂处理法：表面活性剂能与磷脂及脂蛋白作用，破坏细胞膜结构 4）酶解法 自溶法：在一定pH和温度条件下，细胞自身酶类的作用而导致细胞壁的破碎 外加酶法：使用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶，在一定条件下作用于细胞而使细胞壁破碎 2、酶的抽提（extraction） 把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，以便进一步从中分离纯化 1）酸、碱溶液提取 2）盐溶液提取 3）有机溶剂提取 1）酸、碱溶液提取 酶是蛋白质，具有等电点（PI） 为了增加酶的溶解度，提取时pH应远离酶的等电点 碱性蛋白酶用偏酸性缓冲