091218植物病原细菌学实验课件详解.ppt

植物病原细菌学实验 二、实验内容和操作方法 实验二 植物病原细菌的分离 和致病性测定 二、实验内容和操作方法 实验三　植物病原细菌的形态观察? 二、实验内容和操作方法 实验五 植物病原细菌的PCR分子鉴定 ? 1、PCR反应： A. 取0.5ml 的eppendorf 管中依次加入效率试剂（共50?l）: 35?l H20 5?l 10X PCR反应缓冲液 4?l 25 mmol/L MgCl2 4?l 4种 dNTP 0.5?l 上游引物（引物1） 0.5?l 下游引物（引物2） 0.5?l 模板DNA(约1ng) 0.5ul Taq DNA聚合酶（约2.5单位） 混匀后离心5秒钟 B．混合物在94℃下加热5min 。 C．94 ℃变性30秒种，62℃退火1分钟，72℃延伸2分 钟，循环30轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，于 72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。 2、电泳：取10 ul扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。 1 了解PCR反应的原理； 掌握PCR反应的操作方法。 一、实验目的 二、PCR扩增 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR） 1、PCR技术的基本原理 　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与目标序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（以便它与引物结合，为下轮反应作准备）； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2 The procedure of PCR 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Taq Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ component denaturation 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ (94℃) extension 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 5’ repeated anneal (72℃) (50℃) 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 2 cycles 4 copies 3 cycles 8 copies 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 10×反应缓冲液（含Mg2＋） 5.0 ?l dNTP混合物，10 mmol/L 1.0 ?l 上游引物，20 ?mol/L 1.0 ?l 下游引物，20 ?mol/L 1.0 ?l 模板DNA 1.0 ?l Taq plus DNA聚合酶，5 U/?l 0.5 ?l 加双蒸水至终体积为50 ?l ? 3 反应体系 取一0.5 ml PCR薄壁管，依次加入以下试剂： M 1 2 3 4 ? 3kb 2kb 0.8% agrose gel electrophoresis of full length PCR product from Y160 M: DNA marker; 1: Y160; 2:positive control; 3 4: CK- 2.7kb 引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或