低温诱导毛白杨抗冻性与甜杨抗冻蛋白的研究.docVIP

低温诱导毛白杨抗冻性与甜杨抗冻蛋白的研究 （作者：林善枝 导师：张志毅） 摘要 毛白杨（Populus tomentosa Carr.）属杨柳科（Salicacae）杨属（Populus L.）白杨派（Section Leuce Duby）杨树，是我国独有的乡土树种，为北方地区造林和平原绿化的主要树种。而由于毛白杨的抗冻性存在一定局限性，低温寒冷和冻害已成为毛白杨向北扩大栽培区域的主要限制因子。因此，为了进一步提高毛白杨的经济、生态和社会效益，扩大其种植区域，尤其把毛白杨推广栽种到更高纬度的寒冷地区，培育抗冻性较强的毛白杨新品种已迫在眉睫。 解决毛白杨北移冻害问题的重点是进行抗冻性遗传改良，而了解毛白杨自身抗冻性以及发生冻害的机理是其抗冻性改良和培育抗冻性较强的毛白杨新品种的重要前提。为此本论文一方面以当年扦插繁殖的毛白杨新品种幼苗为试材，以细胞抗冻性及膜稳定性的相关理化指标为依据，对毛白杨幼苗抗冻性进行了较系统的研究，在此基础上对其发生冻害的可能机理进行了深入探讨。另一方面以比较抗冻抗旱的甜杨为试材，开展抗冻蛋白特性研究，研究的最终目的是分离出抗冻蛋白和克隆其基因，并期望将其用于改良毛白杨等杨树的抗冻性能。本论文的主要研究结果如下： 1）首次对毛白杨幼苗的低温诱导条件进行了研究。结果表明：-3 oC是毛白杨幼苗在生长期发生冻害的临界温度，1 oC的低温锻炼即可开始影响毛白杨幼苗的抗冻性，-3 oC低温锻炼对幼苗抗冻性发育最有效，其锻炼的适宜天数为5天。反映了毛白杨幼苗抗冻性的诱导与发育需要一定的温度和锻炼时间。另外，在-3 oC锻炼期间，结合适当光照的低温锻炼能更有效地促进毛白杨幼苗抗冻性的提高。 2）第一次研究了四种不同CaCl2浓度（1、5、10、15mmol/L）处理对毛白杨幼苗抗冻性的效应。结果发现，不同浓度CaCl2处理对毛白杨幼苗抗冻性的作用效应是不同的，其中10mmol/L CaCl2浓度处理对幼苗抗冻性的提高效应最为明显，处理适宜天数为5天。 3）采用CaCl2处理结合低温锻炼的方法，对在有无CaCl2处理的低温锻炼中和在低温胁迫下及随后的回常温恢复生长中毛白杨幼苗的可溶性蛋白、钙调蛋白（CaM）、膜保护酶（SOD、POD）、丙二醛（MDA）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDHase) 、质膜和线粒体Ca2+-ATPase、核糖核酸（RNA）、可溶性糖及抗冻性等动态变化进行了系统研究，同时对单纯低温锻炼和结合CaCl2处理的低温锻炼对幼苗抗冻性的作用效应进行了比较分析。结果表明：单纯低温锻炼在一定程度上能提高毛白杨幼苗的抗冻性，而结合CaCl2处理的低温锻炼的效果更明显，表现出幼苗的CaM、RNA含量和膜保护酶（SOD、POD）、G6PDHase以及质膜和线粒体Ca2+-ATPase活性的明显提高，同时增加了可溶性蛋白中热稳定蛋白的含量，降低了MDA含量和核糖核酸酶（RNase）活性。结合CaCl2处理的低温锻炼能减小了低温胁迫所引起的CaM含量、SOD、POD、G6PDHase、Ca2+-ATPase活性以及热稳定蛋白含量等的下降程度，并能在一定程度上抑制MDA含量和RNase活性的增加；同时不仅有利于幼苗在胁迫后恢复过程中CaM、SOD、POD、G6PDHase、Ca2+-ATPase及热稳定蛋白水平的迅速回升和MDA含量及RNase活性的下降，而且有利于幼苗恢复生长。由此可认为低温锻炼是一个活跃的生理生化过程，抗冻性的发育与提高是低温锻炼所引起的一系列生理生化适应性变化的综合结果。结合CaCl2处理的低温锻炼之所以能较大幅度地提高了毛白杨幼苗抗冻性的一个表现是能较快而又明显地提高了CaM含量，进一步激活并调节可能依赖于Ca2+-CaM的酶类（SOD、POD、G6PDHase和Ca2+-ATPase）活性, 而这些酶活性变化的综合结果是使它们能在低温下行使其功能，如促进幼苗体内PPP途径的提高、加强ATP水解作用、增强消除细胞活性氧能力，从而为抗冻性的形成与提高有关的RNA、蛋白质等物质的合成提供基础，最终导致幼苗膜稳定性和抗冻性的明显提高，体现在幼苗抵御低温胁迫及恢复生长能力的明显增强。 4）首次进行了在毛白杨抗冻性的低温诱导中钙离子螯合剂EGTA、钙离子通道阻断剂LaCl3和钙调素拮抗剂CPZ的抑制实验。结果表明，这三种效应剂处理强烈减弱低温锻炼的效果，表现在明显降低了幼苗SOD、POD、G6PDHase、Ca2+-ATPase活性以及CaM、热稳定蛋白、RNA含量的同时，也妨碍了低温诱导幼苗抗冻性的获得。进一步分析发现，无论是单纯的低温锻炼还是结合CaCl2处理的低温锻炼，幼苗中SOD、POD、G6PDHase、Ca2+-ATPase活性以及热稳定蛋白含量的变化与CaM含量