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细胞器的分离、纯化 — 细胞分级分离法 —秦川 实验目的 实验原理 实验用品 实验方法 应用范围： 1.病毒及亚细胞 组份分离 2.蛋白梯度分离 3.脂蛋白分离 4.RNA梯度沉淀 5.质粒DNA提纯 Back 认识离心机及学习离心机的使用方法 学习细胞器的分离及纯化的一般原理和方法 实验目的 Back 实验原理 离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颖粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的分离分析技术。 细胞分级分离式一种通过离心从而分离细胞内不同结构成分的细胞器。不同的细胞器的大小和密度不同，在同一离心场内的沉降速度不同，用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯度平衡离心法分离细胞器。 差速离心法是从低到高不同的转速离心，使较大的颗粒先在低转速中沉淀，再用较高转速将原来悬浮的小颗粒物质沉淀下来，从而达到逐级分离。 相对离心力（RCF） 由于转头有不同的制造商制造，半径不同，故用相对离心力来表示离心力的大小。 RCF (×g) = Fc/F重力 = mG/mg = r·ω2/g = 1.119×10-5·N2·r =11.2r(N/1000)2 也有： 根据这个公式，相对离心力（RCF）和每分钟转数（N）之间便可以互换，这种互换关系是很有实用价值的。 Back 为了简便 实验用品 材料：新鲜菠菜 器材： 显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心管、200目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器。 试剂： ① 线粒体离心匀浆介质。 ② 1%詹纳斯绿B的0.25M蔗糖溶液。 ③ 0.05M Tris-HCl液体 Ph=8.0 ④ 0.35mol/L NaCl Back 匀浆介质，一般为一定浓度的蔗糖溶液加入其它离子成分，可以维持亚细胞组分的渗透压。 台式高、超速离心机 0.6-10万rpm 离心机 制备性 分析性 分析性超速离心机 普通离心机 冰冻离心机 台式（或地面式）普通离心机 大容量冰冻离心机 小于0.6万rpm 高速冰冻离心机 0.6-2.5万 超速冰冻离心机 2.5-8万或更高 (分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等) 概述 Back ！ 离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。 离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。 Back 一般制备离心 一般制备离心是指在分离、浓缩、提纯样品中，不必制备密度梯度的一次完成的离心操作，实验室用低、高速离心机可应用于此项技术。 台式或地面式普通离心机 Back ?高速冰冻离心机 Back 从低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮在上清液中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离。 差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。 其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。 缺点是：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。 细胞器沉降顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体。 差速离心法： Low speed High speed 差数离心法 Back 密度梯度离心法： 用具有梯度的介质来替换离心管中密度均一的介质，使介质分为不同的层次，浓度低的在上层，高的在底层。细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大小、形态、密度的颗粒，就会以不同的速度向下移动，击中到不同的区域，可以分别收集。 该法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点：① 离心时间较长；②需要制备梯度；③操作严格，不宜掌握。? Back 将离心机转数换算为相对离心力时， 首先，在 r标尺上取已知的半径和在 N 标尺上取已知的离心机转数。 然后，将这两点间划一条直线，在图中间 RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。 注意，若已知的转数值处于 N 标尺的右边，则应读取 RCF 标尺右边的数值；同样，转数值处于 N 标尺左边，则读取 RCF标尺左边的